بشر در طول قرن ها به گیاهان به عنوان منبعی از کربوهیدرات، پروتئین و چربی وابستگی کامل داشته است. عمدتاً یکسری از واکنش های شیمیایی که واسطه آنزیمی دارند، در گیاه زنده به عنوان متابولیسم شناخته می شوند. این واکنش های شیمیایی با هم هماهنگ شده تا مسیرهای متابولیکی که در آنها سنتز مولکولهایی مثل قندها، اسیدهای آمینه، اسیدهای چرب عمده، نوکلئوتیدها و پلیمرهای حاصل از آنها (DNA RNA,) انجام می شود، به دست آیند. این تجمع به عنوان متابولیسم اولیه در نظر گرفته می شود و ترکیبات تولید شده که برای زنده ماندن و سالم ماندن گیاه لازم هستند متابولیت اولیه نامیده می شوند. همچنین در گیاهان، مسیرهای متابولیکی دیگری نیز وجود دارد که محصول این مسیرها برای گیاه کاملاً مشخص نیست که به این ترکیبات متابولیت های ثانویه اطلاق می گردد و به مسیر تولید آنها متابولیسم ثانویه می- گویند.
متابولیت های اولیه در بین تمام گیاهان مشترک هستند ولی نوع و میزان متابولیت های ثانویه از یک گونه گیاهی به گونه ای دیگر ممکن است متفاوت باشد. متابولیت های ثانویه گیاهی براساس نحوه بیوسنتز به ترپن ها، فنولیک ها و ترکیبات ازت دار تقسیم می شوند [Taiz [Zeiger, 2002.
| جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت abisho.ir مراجعه نمایید. |
۱-۱-نقش دفاعی متابولیت های ثانویه در شرایط تنش
با توجه به این که امروزه نقش دفاعی متابولیت های ثانویه برای همه تقریباً پذیرفته شده است، اما هنوز بررسی سازوکار تأثیر تنش های محیطی بر تولید این مواد تصویر پیچیده و مبهمی پیش روی ما می گذارد.
به طور کلی می توان گفت گیاهان، طیف وسیعی از تنش های محیطی را که نهایتاً منجر به بروز
تنش اکسیداتیو در گیاه می شود، درک می کنند. مکانیسم مقاومت در برخی از تنش ها، به صورت یک ارتباط درونی و نتیجه یک برنامه ریزی هماهنگ و پیچیده است .
متابولیت های ثانویه گیاهان از جمله فنل و فلاونوئید کل با پتانسیل قوی برای پاکسازی رادیکالهای آزاد در تمام قسمت های مختلف گیاهان مانند برگ، میوه، دانه، ریشه و پوست وجود دارند.
۱-۲-رادیکال های آزاد و اثرات سوء آن بر گیاه
دکتر دنهام هارمون اولین کسی بود که رادیکال های آزاد را کشف و به ارتباط بین رادیکال های آزاد و فرایند پیری در انسان اشاره کرد. وی زمانی نظریه ی خود را ارائه کرد که توانست با دادن مواد ضداکسایشی مختلف به برخی پستانداران، به طول عمر آنها اضافه کند[Leduc, 2002].
تولید رادیکال های آزاد مسئله ای طبیعی است و در طی عمل تنفس به وجود می آید. رادیکال
های آزاد مولکول هایی با یک الکترون آزاد آماده واکنش هستند و در حین واکنش اکسیژن با برخی مولکولهای دیگر تولید می شوند. اگر به طور ناگهانی تعداد زیادی از آنها در گیاه تولید شود با بعضی قسمت های سلول مانندDNA و غشای سلول واکنش نشان داده و باعث تخریب عمل سلول یا حتی مرگ آنها می شود. البته در حالت عادی، سیستم دفاعی گیاه این رادیکال های آزاد را خنثی و بی ضرر می کند[Huang, 1992; Suhaj, 2004].
از جمله رادیکال های آزاد تولید شده در گیاهان می توان به گونه های فعال اکسیژن (ROS) اشاره کرد که شامل رادیکال سوپر اکسید (O2)[1]، رادیکال هیدروکسیل (OH)[2]، اکسیژن منفرد (O2)[3] و پراکسید هیدروژن (H2O2)[4] می باشند.
آسیب به غشاء فسفولیپیدی سلول، موجب پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء و سخت شدن دیواره-ی سلولها می شود. در این صورت سلول نمی تواند بصورت متناسب مواد غذایی مورد نیاز و نیز سیگنال هایی که از دیگر سلولها برای اجرای یک عمل صادر می شود (نظیر تکانه های عصبی) را دریافت کند و بدین ترتیب بسیاری از فعالیت های سلول تحت تاثیر قرار می گیرد[Leduc, [2002.
ناتوانی گیاه در شرایط تنش زا برای مهار انواع اکسیژن فعال (ROS) در نهایت باعث بروز علائم ناشی از صدمات اکسیداتیو می شود که برای کاهش اثرات سمی تنش اکسیداتیو، مکانیسم های متنوع دفاعی در گیاه باید فعال شود ]کافی و همکاران، ۱۳۸۲٫[
با فعال شدن مکانیسم های دفاعی میزان آنتی اکسیدانها افزایش یافته و آنزیم های مهار کننده ROS ها در جهت کاهش اثرات سمی ناشی از تنش اکسیداتیو، افزایش پیدا می کنند ]کافی و همکاران، ۱۳۸۲٫[
۱-۳-مکانیسم های دفاعی گیاهان در برابر گونه های فعال اکسیژن (ROS)ها
در حال حاضر ROS ها مسئول برخی آسیب های جدی القا شده به وسیله ی تنش ها به غشاء سلولی و ماکرومولکول های اساسی شامل رنگیزه های فتوسنتزی، پروتئین ها، اسیدهای هسته- ای و لیپیدها هستند.
گزارشهای مختلفی بیان می کنند که تنش اکسیداتیو افزایشی را در پاسخ سیستم های آنزیمی مربوط به فرایندهای جاروب کردن گونه های فعال اکسیژن تحریک می کند[ Joans [Smirnoff, 2005 Apel Hirt, 2000.
در واقع پاسخ آنتی اکسیدانی، فرآیندی مهم برای محافظت گیاهان در مقابل آسیب های اکسیداتیوی است که در اثر طیف وسیعی از تنش های محیطی شامل شوری، خشکی، فلزات سنگین و سرما و غیره ایجاد می شود.
آنتی اکسیدان ها به موادی گفته می شود که قادر به ایجاد تأخیر، کُندکردن و حتی توقف فرایندهای اکسیداسیون می باشند. این ترکیبات می توانند به نحو مطلوبی از تغییر در رنگ و طعم مواد غذایی در نتیجه واکنش های اکسیداسیون جلوگیری کنند.[ Halliwel et al., [1995.
ترکیبات ضداکسایشی براساس مکانیسم واکنش آنها اغلب به دو گروه عمده طبقه بندی میشوند: گروه اول ضداکساینده های شکننده زنجیر رادیکالها و گروه دوم ضد اکساینده های مهارکننده رادیکالها. ضداکساینده های گروه اول، رادیکال های آزاد واکنش پذیری مثل هیدروکسیل را از طریق واکنش انتقال اتم هیدروژن بین هیدروکسیل و ضداکساینده ها، به مولکولهای پایدار تبدیل می کنند. در نتیجه واکنش های زنجیرهای اتواکسیداسیون بین رادیکال های آزاد و مولکولهای سلولی به اتمام می رسد.
گروه دوم، واکنش مهار اکسیداسیون را هم از طریق تبدیل پیش سازهای واکنش اکسیداسیون به گونه های غیرفعال و هم از طریق مهار ROS ها انجام می دهند .این گروه شامل ضداکساینده-های آنزیمی و غیرآنزیمی می باشد.
سیستم آنزیمی شامل آنزیم های کاتالاز(CAT)، سوپراکسید دیسموتاز(SOD)، دهیدروآسکوربات ردوکتاز(DHAR)، آسکوربیک پراکسیداز(APOX) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR)می باشد. سیستم غیرآنزیمی شامل آسکوربیک اسید(ASA)، آلفاتوکوفرول)ویتامین(E ، گلوتاتیون(GS)، کاروتنوئیدها و ترکیبات فنلی می باشد.[Yordanova, 2003 ]
۱-۴-اهمیت آنتی اکسیدان های گیاهی
مواد اکسید کننده و رادیکالها به عنوان عوامل واسطه بیماری ها در انسان شناخته شده اند اما عموماً توسط آنتی اکسیدانها در اشخاص سالم، خنثی می شوند.
آنتی اکسیدانها از لحاظ بیولوژیکی ترکیباتی فعال محسوب می شوند و از دیدگاه سلامت شغلی نیز دارای اهمیت هستند چون بدن را در برابر آسیب های ناشی از گونه های فعال اکسیژن(ROS)، گونه-های فعال نیتروژن (RNS)و گونه های فعال کلر(RCS) که منجر به بروز بیماریها می شوند محافظت می نمایند. از طرفی مطالعات اپیدمیولوژیکی حکایت از آن دارد که جذب آنتی اکسیدان ها از منابع غذایی رژیمی در پیشگیری و درمان بسیاری از بیماریها مرتبط است .[ Hamad et al., 2010 ]گزارشات اخیر نیز دلالت بر وجود یک ارتباط معکوس بین رژیم های غذایی شامل غذاهای غنی از ضداکساینده و بروز بیماریهای انسانی دارد، به همین جهت بدن نیاز به دریافت آنتی اکسیدانها از منابع خارجی دارد که ازطریق منابع غذایی تأمین می شود .
شواهد بسیار زیادی وجود دارد که سمی بودن و اثرات سوء تغذیه ای آنتی اکسیدانهای ساختگی اضافه شده به مواد غذایی مانند بوتیل هیدروکسی آنیزول(BHA)، بوتیل هیدروکسی تولوئن (BHT) و ترت بتا هیدروکسی کینون (TBHQ)را تأیید می کند. علاوه بر این آثار سوء، خطرات آسیب کبدی و ایجاد سرطان در حیوانات آزمایشگاهی از معایب استفاده از آنتی- اکسیدانهای ساختگی می باشد. بنابراین نیاز به آنتی اکسیدانهای قوی با سمیت کمتر و اثر بخشی بیشتر یک ضرورت اجتناب ناپذیر است[Frankel, 1999 ].
پس گیاهانی که غنی از ترکیبات آنتی اکسیدان بوده می توانند باعث حفاظت سلولها از آسیبهای اکسیداتیو شوند، که این درجه فعالیت آنتی-اکسیدانی و میزان افزایش آنتی اکسیدانهای گیاهی به گونه ی گیاه، مرحله ی نموی، شرایط متابولیک، طول مدت و شدت تنش بستگی دارد.
۱-۵-ویژگی های آنتی اکسیدانی ترکیبات فنلی
این ترکیبات گروه بزرگی از مواد طبیعی گیاهی شامل فلاونوئیدها، تانن ها، آنتوسیانین ها و غیره می باشند که معمولا در میوه جات، سبزیجات، برگ ها، دانه، ریشه و در سایر قسمت های گیاه دیده می شوند. این مواد منافع قابل توجهی در زمینه صنایع غذایی، داروسازی و پزشکی با توجه به طیف گسترده ای از اثرات مطلوب زیستی از جمله خواص آنتی اکسیدانی، دارند.
ترکیبات فنلی با داشتن خاصیت آنتی اکسیدانی و آنتی رادیکالی می توانند نقش مهمی در حفظ سلامتی انسان ایفا نمایند[Shariatifar, 2011 ]. چون اثرات سلامتی بخش و مفید مصرف مواد غذایی گیاهی تا حدودی به حضور مواد فنلی نسبت داده می شود که با خطرات ناشی از بیماری های قلبی-عروقی، سرطان، آب مروارید و بیماری های مختلف در تقابل هستند. این اثرات از طریق جلوگیری از اکسیداسیون چربی ها، جهش DNA و در مراحل بعدی آسیب بافتی حاصل می شوند[Pekkarinen et al., 2004].
ترکیبات فنلی از توانایی جاروب کردن رادیکال های آزاد از قبیل گونه های فعال اکسیژن برخوردارند که این توانایی توسط قابلیت آنها به عنوان عوامل دهنده ی هیدروژن یا الکترون شکل گرفته است.[Fernandez-Pachon et al., 2006 ] بنابراین با توجه به شیوع بالای بیماریهای مزمن و فرسایشی منطقی است که برای تأمین آنتی اکسیدانهای مورد نیاز بدن از گیاهان استفاده شود و به خصوص گیاهانی که فنل و فلاونوئید کل بالایی داشته باشند.
در نهایت تثبیت دوباره تعادل بین مواد اکسید کننده و آنتی اکسیدان به سلول ها اجازه می دهد تا عمل فیزیولوژیک نرمال خود را مجددا بدست آورند[Schieber et al., 2001 ].
۱-۶-مبحث اسانس
۱-۶-۱-روغن های اسانسی
طبق یک تعریف زیست شناختی روغن های اسانسی مخلوط پیچیده ای از بو ها و ترکیبات فرار با بخار هستند که از اندام های مختلف یک گیاه قابل استخراج می باشند کوشک آبادی، ۱۳۵۹ [. به طور کلی اسانس ها با آب قابل امتزاج نیستند ولی بویشان در آب ماندگار است. حلال اصلی آنها الکل، اتر و سایر حلال های آلی می باشد.
روغن های اسانسی در هنگام استخراج معمولا بیرنگ هستند ولی پس از مدتی در مجاورت هوا اکسید شده و تیره می شوند و یا اینکه بصورت رزین در می آیند. بنابراین برای جلوگیری از تغییر رنگ باید آنها را در محل های تاریک و خشک با درپوش های مطمئن نگاهداری کرد.
۱-۶-۲-مصارف و کاربرد روغن های اسانسی
تعداد زیادی از گیاهان معطر به علت داشتن اسانس مورد استفاده قرار می گیرند. مهمترین کاربرد گیاهان معطر و اسانس های حاصل از آنها، معطر ساختن مواد غذایی می باشد. در اکثر مواقع اسانسهای استخراج شده از گیاهان به عنوان دارو بکار می روند. اسانس ها علاوه بر مصارف دارویی، در صنایع غذایی، بهداشتی و آرایشی بکار می روند. اسانس ها ممکن است دارای خاصیت دورکنندگی حشرات باشند و بدین وسیله از خراب شدن گلها و برگها جلوگیری می کنند و یا ممکن است به عنوان جلب کننده حشرات، عمل گرده افشانی را تسهیل نماید.
مشخص شده است که اغلب اسانس های گیاهی استخراج شده از گیاهان دارای خواص حشره کشی، ضد قارچی، ضد انگل، ضد باکتری، ضد ویروس، آنتی اکسیدانی و سیتوتوکسیک می- باشند.
بنابراین اسانس های گیاهی در زمینه های فارماکولوژیکی، داروشناسی گیاهی، میکروبیولوژی پزشکی، کلینیکی و فیتوپاتولوژی شدیداً غربالگری شده و مورد استفاده قرارگرفته-اند.
۱-۶-۳-روش های استخراج روغن های اسانسی
به دلیل کاربرد اسانس های اکثر گیاهان معطر در صنایع مختلف، یافتن بهترین روش استخراج برای بهبود کیفیت اسانس ها در راستای رسیدن به مناسب ترین ترکیب شیمیایی مورد نظر ضروری است. عمده ترین روش های تولید روغن های اسانسی بدین ترتیب می باشد:
الف) روش تقطیر که شامل تقطیر با آب، تقطیر با بخار آب، تقطیر با آب و بخار آب، تقطیر در خلاء و تقطیرمولکولی می باشد.
ب) روش عصاره گیری که شامل فشردن، استفاده از حلال های آلی فرار، استفاده از حلال های غیر فرار در دمای محیط و استفاده از حلال های غیر فرار طی حرارت می باشد.
ج) روش کاربرد گاز CO2
۱-۶-۴-روش های جداسازی ترکیبات روغن های اسانسی
روغن های اسانسی معمولا مخلوط پیچیده ای از ترکیبات شیمیایی می باشند. بیشتر روغن ها از یک یا چند ترکیب اصلی و در کنار این ترکیب های اصلی، ترکیباتی دیگر با اهمیت کمتر تشکیل شده اند. بدلیل تنوع زیاد در میزان ترکیبات مختلف موجود در روغنها، مشکلات زیادی نیز ممکن است در جداسازی آنها بوجود آید. برای جداسازی ترکیبات روغن های اسانسی از روش های زیر استفاده می شود:
الف) تقطیر جزء به جزء
ب) کروماتوگرافی ستون مایع
ج) کروماتوگرافی لایه نازک
د) کروماتوگرافی گازی
ه) کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
و) کروماتوگرافی جریان متقاطع قطره ای
ز) کروماتوگرافی جریان متقاطع محفظه ای چرخشی
۱-۶-۴-۱-روش کروماتوگرافی گازی(GC)[5]
کروماتوگرافی گازی که امروزه کاربرد گسترده ای دارد روشی برای جداسازی و اندازه گیری اجزای فرار یک مخلوط در حداقل زمان بدون تجزیه شدن آنها می باشد.
قسمت های گوناگون دستگاه GC عبارت است از:
۱- سیلندر گاز حامل(Carrier Gas Tank or Cylinder )
(Flow & Pressure Regulators) ادوات تنظیم فشار و جریان ۲-
(Sample Injection Chamber) محل تزریق نمونه ۳-
(Column) ستون ۴-
(Detector) آشکارساز ۵-
(Oven) محفظه های گرمکن ۶-
(Recorder, Data System & Displayer) ثبات، داده پرداز و نمایشگر ۷-
در کروماتوگرافی گازی فاز متحرک یک گاز بی اثر( هلیوم، نیتروژن، آرگون یا دی اکسید کربن) می باشد که معمولاً گاز حامل (Carrier Gas) نامیده میشود و در سیلندرهای گاز ذخیره می گردد. گاز حامل برای ورود به دستگاه GC باید فشار و سرعت جریان (Flow) ثابتی که توسط کنترل کننده های فشار دائماً تنظیم می گردند، داشته باشد. نمونه های مورد آنالیز توسط سیستم تزریق(Injector) به درون ستون وارد می گردند. عمل جداسازی اجزاء توسط ستون انجام می گیرد و سپس این اجزاء شسته شده(elute) و توسط آشکارساز (Detector) تشخیص داده می شوند .خروجی آشکارساز توسط یک آمپلی فایر تقویت شده و سپس به یک سیستم ثبات فرستاده می شود. علایم خروجی از آشکارساز که به صورت میلی ولت بر حسب زمان ترسیم می شود یک کروماتوگرام (Chromatogram) نامیده می گردد .امروزه سیستم-های ثبات به صورت کامپیوتری و با نرم افزارهای مجهز نظیر Galaxy،Stare ،Azur و Maitre امکان تجزیه و تحلیل کروماتوگرام را در حالت های مختلف فراهم نموده است. یک کروماتوگرام، شامل یک سری از پیک هاست که با اجزاء موجود در نمونه مطابقت دارند و در یک جهت روی یک خط پایه(Base. Line) قرار می گیرند. شناسایی پیک ها یا آنالیز کیفی (Qualitative Analysis) بر اساس زمان بازداری یعنی زمانی که طول می کشد تا ترکیب از محل تزریق شسته شود و در نهایت از ستون خارج شود، استوار است و آنالیز کمی بر اساس اندازه یا سطح زیر پیک (area) به دست می آید.
۱-۶-۵-بررسی تکنیک کروماتوگرافی گازی-طیف سنج جرمی (GC/MS) [۶]
این تکنیک یکی از مؤثرترین تکنیک ها برای جداسازی، آشکارسازی و تعیین ساختار ترکیبهای مخلوط های آلی پیچیده می باشد. در این دستگاه مولکول های گازی باردار بر اساس جرم آنها دسته بندی می شوند. دستگاه GC/MS از دو قسمت GC (گاز کروماتوگرافی) و Mass (طیف سنجی جرمی) تشکیل شده است. این دستگاه مشابه دستگاه GC است، تنها تفاوت آن با GC معمولی این است که در این دستگاه آشکارساز مربوطه، آشکارساز Mass است.
در این دستگاه GC و Mass از هم جدا نمی باشند و وارد کردن نمونه به دستگاه Mass از طریق GC می باشد. در این روش، اجزاء مختلف اسانس یا نمونه های فرار با نقطهی جوش پایین جداسازی می شوند. طیف سنجی جرمی به عنوان آشکارساز امکان شناسایی پیک های کروماتوگرام گازی را میسر می سازد. از مقایسه ی الگوهای شکست پیوندها و طیف جرمی اسانس با طیف جرمی موجود در کتابخانه ی دستگاه، ساختار ترکیب مجهول را می توان تعیین نمود.
۱-۷-مبحث آللوپاتی
علفهای هرز گیاهان خودرویی هستند که در محلهای نامناسب روییده و رقیبی برای گیاهان کشت شده می باشند و از لحاظ قدرت زندگی و مقاومت در شرایط نامساعد بر گیاهان اصلاح شده زراعی برتری دارند] سپاسگذاریان، ۱۳۵۷ [. علفهای هرز از طریق راه های مختلف، رشد گیاهان اصلی کشت را تحت تأثیر قرار می دهند و به طور کلی از تمام عواملی که در رشد و مقدار محصول گیاهان زراعی مؤثر است استفاده کرده و عرصه را برای رشد و نمو و تولید محصولات گیاهان زراعی تنگ می کنند ] عصاره و همکاران، ۱۳۸۶[. استفاده از علف کشهایی که منشأ بیولوژیک دارند به دلیل نداشتن اثرات آلوده کننده برای محیط زیست از اهمیت خاصی برخوردارند. امروزه پژوهش های گسترده ای در رابطه با بهره گرفتن از مواد شیمیایی مختلف سنتز شده توسط گیاهان، جهت کنترل علفهای هرز در جریان است.
در سال ۱۹۹۸جامعه آللوپاتیک هر گونه فرآیندی که از طریق تولید متابولیتهای ثانویه تولید شده توسط گیاه، جلبک، باکتری و ویروس بر رشد و نمو سیستم های بیولوژیک و کشاورزی تأثیر بگذارد را دگرآسیبی (آللوپاتی) خواند. در نتیجه این تعریف مکانیسم های در برگیرنده گیاه-گیاه، گیاه-میکروارگانیزم، گیاه-ویروس، گیاه-حشره و بر هم کنش گیاه-خاک-گیاه را نیز شامل می شود[Gniazowska, 2005 ].
اگر چه تعریف دگرآسیبی هم جنبه های مثبت و هم منفی عمل ترکیبات شیمیایی را در بر می گیرد اما بیشتر مشاهدات جنبه منفی این ترکیبات را تأیید می کند[Gniazowska, [2005.
ترکیبات آللوشیمیایی تقریبا در تمامی قسمت های گیاه از جمله برگ ها، گل، میوه، ساقه، ریزوم و دانه وجود دارد[ Dulce, 1985 ].
تحقیقات نشان داده است که اسانس های روغنی و عصاره های استخراج شده از اندام های مختلف گیاهان دارای اثر آللوپاتیک می باشند[Duke, 1985 ].
مواد آللوشیمیایی می توانند به روش های مختلفی نظیر تراوش از ریشه، نشت کردن و تجزیه بقایای گیاه از بافت های گیاهی آزاد شوند.[Duke, 1985 ] همچنین مواد شیمیایی متنوعی می تواند از بخش های هوایی گیاه به وسیله باران یا قطرات شبنم نشت کنند[Cook, 1921].
از میان این ترکیبات می توان اسیدهای آلی، قندها، اسیدهای آمینه، ترکیبات پکتیک، اسیدجیبرلیک، ترپنوئیدها و ترکیبات فنلی را نام برد[ Dulce, 1985 ].
طیف وسیعی از مواد آللوشیمیایی قادرند با تغییر در مقدار کلروفیل در فرایند فتوسنتز گیاهان تحت تیمار، اثر بگذارند. کاهش در مقدار کلروفیل می تواند در اثر افزایش فرایندهای متابولیسمی مربوط به سنتز رنگدانه های فتوسنتزی جدید باشد. علاوه بر این، علت کاهش کلروفیل ممکن است مربوط به آسیب هایی باشد که به سیستم های فتوسنتزی وارد آمده است.
در بیشتر گزارش های مربوط به دگر آسیبی، مهار رشد با کاهش کلروفیل همراه است که ممکن است نسبت به خسارت های دیگر سلولی یک اثر ثانویه ناشی از عملکرد مواد آللوشیمیایی ویژه-ای باشد.
یکی از توضیحات پیشنهادی در مورد توقف رشد و نمو دانه رستها طی تنش آللوپاتیک تغییر نرخ تنفس میتوکندریایی است که باعث کاهش تولیدATP می شود. دیده شده است که کوماریل موجود در عصاره اکالیپتوس نرخ تنفس میتوکندریایی را در پیاز کاهش داده است .
کاهش تولید ATP می تواند باعث تغییر در سایر فرآیندهای سلولی از جمله جذب یونها و رشد که مراحل پر مصرفی از نظر انرژی هستند، شود. کاهش رشد گیاه در حضور ترکیبات آللوپاتیک با توقف شدید میتوز در سلولهای مریستمی ریشه چه و ساقه چه همراه می شود و در نتیجه طول ریشه چه و ساقه چه کاهش می یابد.
طبق گزارش Pandy و همکارانش افزایش غلظت عصاره اکالیپتوس نرخ تنفس، فعالیت آنزیم های کاتالاز و آمیلاز را کاهش می دهد. آنها نتیجه گرفتند که این امر باعث تغییر در ماکرومولکولها، پروتئینها و نوکلئیک ها اسید می شود.
افزایش محتوای رنگدانه های کاروتنوئیدی و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان می تواند از واکنشهای گیاه برای غلبه بر تنش های آللوپاتیکی باشد.
در نهایت می توان نتیجه گرفت که متابولیت های ثانویه گیاهی به عنوان آللوکمیکال ها، فقط بر یک عمل فیزیولوژیکی مؤثر نبوده و بر اعمال متعددی از جمله جوانه زنی دانه، تقسیم سلولی، طویل شدن سلولی، نفوذپذیری غشاء، جذب یون و فعالیت سیستم های آنتی اکسیدان اثرگذار می باشند.
۱-۸-خصوصیات کلی تیره برگ بو
گیاهان این تیره به صور مختلف درخت یا درختچه ای (به ندرت علفی) همیشه سبز و ناخزان می باشند. گیاهان تیره برگ بو دارای سلول های اسانس دار (غده های تک سلولی)، پراکنده در بخش های مختلف و سلول های موسیلاژدار، مخصوصاً در ناحیه پوست می باشند. از مشخصات آنها این است که عموما برگهایی متناوب یا متقابل، ساده، بدون استیپول و غالباً چرمی دارند. همچنین گلهایی منظم و مجتمع بصورت خوشه یا گرزن متراکم دارند. پوشش گل آنها شامل دو ردیف ۳ تایی و نافه گل آنها مرکب از ۴ردیف ۳ تایی از پرچم هاست. داخلی ترین ردیف پرچم-ها نیز حالت غیر زایا (استامینود) دارد. مادگی گلهای آنها مرکب از یک برچه و میوه آنها شفت و محتوی دانه بدون آلبومین ولی با جنین حجیم و لپه های روغن دار است] زرگری، ۱۳۶۹[.
۱-۹-خصوصیات گیاه شناسی گیاه برگ بو
برگ بو با نام علمی Laurus nobilis و نام های عمومی انگلیسیlaurel tree sweet bay گیاهی از تیرهLauraceae است. این تیره دارای ۱۰۰۰ نوع گیاه است که در متجاوز از ۴۰ جنس جای دارند. از جنس های مهم آن Cinnamomum (دارای ۱۰۰ گونه)، Nectandra (۱۰۰ گونه)، Persea (۱۰ گونه) و Laurus (۲ گونه) می باشد] زرگری، ۱۳۶۹[.
این درختِ دو پایه یا پلی گام، برگهای معطر، منفرد، کامل ولی با کناره موجدار، دندانه دار، نوک تیز، بطول ۸ تا ۱۴ و به عرض ۵/۲ تا ۵/۴ سانتیمتر، به رنگ سبز تیره، شفاف در سطح فوقانی پهنک ولی کمرنگتر در سطح تحتانی، بی کرک و چرمی دارد. بوی معطر برگهای آن نیز بر اثر مالش دادن، قوی تر می شود. طعم آنها کمی تلخ ولی بسیار معطر است. برگ بو، گلهایی به صورت دستجات چهارتایی، محصور در یک انولوکر دارد.
میوه اش بصورت سته، بیضوی، به رنگ مایل به آبی و محتوی یک دانه با لپه های گوشت دار و روغنی است. سطح خارجی میوه آن پس از رسیدن به رنگ بنفش در می آید و پس از خشک شدن نیز ظاهر چین دار پیدا می کند. در اینحالت، میوه ها به سهولت به صورت گَرد در می آید. از گَرد میوه های خشک شده آن، تحت اثر بخار آب و فشارهای متوالی، روغنی به رنگ سبز و بسیار معطر تهیه میگردد که به Huile de Laurier موسوم می باشد. قسمت مورد استفاده این درخت، برگ و میوه آنست.
برگ این درخت دارای تانن، یک ماده تلخ، مواد رزینی، پکتینی و اسانسی با رنگ زرد مایل به سبز با بوی مطبوعی می باشد] زرگری، ۱۳۶۹[.
۱-۱۰-خصوصیات اکولوژیکی گیاه برگ بو
گیاهان این تیره مخصوص نواحی حاره کره زمین می باشند. گیاه برگ بو، بومی نواحی مختلف اروپای جنوبی و منطقه مدیترانه است. به علت برگ های بادوام و ظاهر زیبایی که دارد، پرورش آن در ایران معمول گشته بطوری که امروزه در منطقه وسیعی از نواحی شمالی ایران و اماکن دیگر یافت می شود ]زرگری، ۱۳۶۹[.
۱-۱۱-خواص درمانی گیاه برگ بو
اسانس سلولهای این تیره نیز با توجه به گونه مورد نظر دارای بوی معطر و یا نامطبوع می باشد. از نظر درمانی، خواص عده ای از این گیاهان مربوط به وجود همین اسانس ها در بخش های مختلف گیاه می باشد. بطور مثال اسانس برگِ گیاه برگ بو در پیچ خوردگی مفاصل، بواسیر و دردهای روماتیسمی، به صورت مالش دادن بر روی عضو استفاده می شود.
از برگ و میوه برگ بو سابقاً نوعی پماد به نام روغن لوریه (P.de Laurier) تهیه می کردند که برای دامپزشکی کاربرد دارد] زرگری، ۱۳۶۹[.
از روغن میوه برگ بو برای انواع ناراحتی های مفاصل، اعصاب، معده، شکم، رحم، انواعی از تشنجهای عضلانی، گرفتگی عضلات یا سیخ شدن عضلات، انواع دردها، بی حسی در هر نقطه از بدن به صورت سنتی استفاده می شده است ]میر حیدر، ۱۳۷۲؛ [ Martindale 1996.
از اسانس برگ بو برای درمان بیماری سرخک نیز استفاده می شود، ضد شوره سر.
برگ بو جزء گیاهان معطر و دارویی می باشد و اسانس موجود در برگهای آن دارای خواص ضدمیکروبی و ضدباکتریایی می باشد Kivcak et al., 2001 ] ؛. له شده تازه برگ بو برای درمان بواسیر و زخم معده استفاده می شود .
۱-۱۲-سایرکاربردهای گیاه برگ بو
چوب بعضی از گونه های این تیره در صنعت اهمیت فراوان دارد و در نجاری و منبت کاری مورد توجه قرار می گیرد] زرگری، ۱۳۶۹[.
از اسانس برگِ گیاه برگ بو در صنایع غذایی، ادویه، چاشنی، صنایع آرایشی و عطر استفاده می-شود.
از برگ بو در قدیم به عنوان چاشنی غذا و ماده معطر استفاده می شد ولی در حال حاضر در صنعت داروسازی و فرمولاسیون دارو مورد استفاده قرار می گیرد[ Santos et al., 2004 ].
برگ بو در صنعت صابون سازی برای معطر کردن صابون ها و خواص ضد شوره سر و ضد جوش-های پوستی استفاده می شود[ Hafizoglu & Reunanen, 1993 ].
فصل دوم
مروری بر پژوهش های پیشین
۲-۱-پژوهش های انجام شده در زمینه ی اندازه گیری فعالیت آنتی اکسیدانی گیاهان
در پژوهشی با بهره گرفتن از عصاره هیدروالکلی اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی برگهای گیاه برگ بو ) ( Laurus nobilis L.در شهرستان گرگان با بهره گرفتن از روش DPPH [۷]، صورت گرفت. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که درصد مهار رادیکالهای آزاد DPPH در بازه زمانی مشخص شده در غلظت g/ml 100 حدود ۹/۸۶ % و مقدار IC50 در حدود g/ml 5/29 بوده است. این پژوهش نشان داد که از برگهای گیاه برگ بو می توان به عنوان منبعی غنی از آنتی اکسیدان های طبیعی در صنعت داروسازی استفاده کرد] پهلوانی و همکاران، ۱۳۹۰ [.
فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره های Laurus nobilis (bay leaves), Rosimarinus officinalis (rosemary), Salvia officinalis (sage), Origanum marjorana (marjoram), Origanum valgare (oregano), Cinnamonum zeylanicum (cinnamon), Petroselium crispum (parsley), Ocium basilicum (sweet basil), Mentha peperita (mint) با بهره گرفتن از تعدادی از روش های تحلیلی از قبیل روش خاصیت جاروب کنندگی رادیکال پایدار دی فنیل پیکریل هیدرازیل مورد ارزیابی قرار گرفته است. نتایج حاصل از ظرفیت جاروب کنندگی رادیکال DPPH بین ۵/۴۷ % تا ۹۲ % متغیر بوده است.
بالاترین مقدار TAC DPPH [۸] برای عصاره cinnamon و کمترین مقدار برای عصاره parsley بوده است. در این بین ظرفیت آنتی اکسیدانی کل برای عصاره Laurus nobilis ، ۱/۹۱ % گزارش شد [Muchuweti et al., 2007 [.
فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره های Petroselinum crispum ، Ocimum basilicum، Laurus nobilis ،Zingiber officinalis ،Elettaria cardamomum ، Juniperus communis، Carum carvi ،Faeniculum vulgare ،Pimpinella anisum با بهره گرفتن از آزمایشات احیا آهن (Ш)[۹] ، ممانعت از پراکسیداسیون لینولئیک اسید[۱۰] ، کیلات آهن (П)[۱۱] ، پتانسیل جاروب کنندگی رادیکال DPPH مورد ارزیابی قرار گرفته است. بر طبق این پژوهش عصاره های Laurus nobilis و Ocimum basilicum دارای بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی به استثنای کیلات کردن آهن بوده اند و عصاره Petroselinum crispum بهترین عملکرد را در آزمایش کیلات کردن آهن نشان داده، اما در کند کردن پراکسیداسیون لینولئیک اسید به میزان کمتری موثر بوده است[ Hinneburg et al., 2006].
در پژوهشی دیگر ظرفیت آنتی اکسیدانی کل عصاره های آبی ۳۰ گیاه دارویی با بهره گرفتن از روش- های DPPH ، SOD [۱۲] ، ORAC [۱۳] و ABTS [۱۴] مورد بررسی قرار گرفته است. در این مطالعه ظرفیت جاروب کنندگی رادیکال برای عصاره آبی برگ گیاه Laurus nobilis در آزمون DPPH به میزان ۲۰/۱ ۹۳/۱۸ % ، در آزمون SOD به میزان ۰۲۳/۰ ۸۸/۱۷ % ، در آزمون ORAC به میزان mol trolox/g dw 35 2963 و در آزمون ABTS به میزان ۴۴/۰ ۶۱/۱۸ % گزارش شد.
۲-۲-پژوهش های انجام شده در زمینه ی اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی گیاهان
طی تحقیقی محتوی ترکیبات فنلی کل[۱۵] و محتوی فلاونوئیدی کل[۱۶] عصاره هیدروالکلی برگهای گیاه برگ بوL. ) ( Laurus nobilisدر شهرستان گرگان مورد بررسی قرار گرفت. میزان ترکیبات فنلی کل با بهره گرفتن از معرفFolin-Ciocalteu در حدود ۴۸/۰ ۳۷/۵ میلی گرم گالیک اسید بر گرم نمونه خشک (dry sample GAE/g mg ) و میزان فلاونوئیدهای کل عصاره هیدروالکلی برگهای این گیاه با بهره گرفتن از معرف کلرید آلومینیم در حدود ۰۷/۱ ۷/۲۷ میلی گرم کوئرستین بر گرم نمونه خشک ( QE/g dry sample mg) گزارش شد] پهلوانی و همکاران، ۱۳۹۰ [.
بررسی میزان ترکیبات فنلی کل عصاره های Laurus nobilis (bay leaves), Rosimarinus officinalis (rosemary), Salvia officinalis (sage), Origanum marjorana (marjoram), Origanum valgare (oregano), Cinnamonum zeylanicum (cinnamon), Petroselium crispum (parsley), Ocium basilicum (sweet basil), Mentha peperita (mint) با بهره گرفتن از روش Folin-Ciocalteu نشان داد که مقدار کل ترکیبات فنلی این گیاهان از ( mg GAE g-1 Extract 90/6 ) تا ( mg GAE g-1 Extract 83/15 ) متغیر بوده است. نتایج بدست آمده به صورت Oregano > cinnamon > sweet basil > bay leaves > mint > sago > rosemary > parsley > marjoram گزارش شد. طی این تحقیق مقدار کل ترکیبات فنلی برای عصاره Laurus nobilis ، mg GAE g-1 Extract 12 بررسی شد [Muchuweti et al., 2007 ].
ترکیبات فنلی می توانند مسئول فعالیت آنتی اکسیدانی گیاهان باشند. در پژوهشی مقدار کل ترکیبات فنلی عصاره های Petroselinum crispum ، Ocimum basilicum، Laurus nobilis ،Zingiber officinalis ،Elettaria cardamomum ، Juniperus communis، Carum carvi ،Faeniculum vulgare ،Pimpinella anisum توسط روش Folin-Ciocalteu بررسی شده است. مقدار ترکیبات فنلی کل به صورت میلی گرم گالیک اسید بر گرم عصاره بیان شده و نتایج بدست آمده به صورت Laurus nobilis > Carum carvi > Foeniculum vulgare> Ocimum basilicum است. Juniperus communi دارای پایین ترین مقدار کل ترکیباتی بوده است. ترکیبات فنلی ارتباط خوبی با اکثر سنجش های فعالیت آنتی اکسیدانی از قبیل احیاء آهن، ممانعت از پراکسیداسیون لیپید نشان داده است[ Hinneburg et al., 2006].
در پژوهشی دیگر ترکیبات فنلی کل عصاره های آبی ۳۰ گیاه دارویی با بهره گرفتن از روش Folin-Ciocalteu نشان داد که مقدار کل ترکیبات فنلی این گیاهان از ( mg GAE g-1 Extract 11/0 86/6 ) تا ( mg GAE g-1 Extract 05/0 03/397 ) متغیر بوده است. طی این پژوهش میزان ترکیبات فنلی کل برای عصاره آبی برگ گیاه Laurus nobilis به میزان mg GAE g-1 Extract 23/0 85/59 تعیین شد.
۲-۳-پژوهش های انجام شده در زمینه ی شناسایی ترکیبات موجود در اسانس گیاهان
در پژوهشی اسانس برگ گیاه برگ بو در فرانسه به روش تقطیر با آب استخراج و مورد بررسی قرار گرفته است. بازده اسانس پس از ۲ ساعت اسانس گیری ۵۷/۰ % (W/W) و درصد برخی از عمده ترین ترکیب های آن همچون ۱,۸-Cineole ، -Terpinyl acetate و Sabinene به ترتیب برابر ۱/۳۹%، ۲/۱۸ % و ۴/۴ % گزارش شده استFiorini et al., 1997 ] [.
در تحقیقی دیگر، برگ های گیاه برگ بو از مناطق مختلف در ترکیه جمع آوری شده و ترکیب-های موجود در اسانس آن مورد بررسی قرار گرفته است. طبق نتایج حاصل از این پژوهش ترکیبات ۱,۸-Cineole ، -Terpinyl acetate و Sabinene بیشترین حجم کل اسانس را به خود اختصاص داده بودند.
طی پژوهشی اسانس برگ گیاه Laurus nobilis L. پس از جمع آوری در فصل گلدهی به روش تقطیر با آب ( به مدت ۳ ساعت ) استخراج گردید. بازده اسانس ۱/۲ % (W/W) با اجزاء اصلی ۱,۸-Cineole (8/55%)، -Terpinyl acetate (1/15%)، Terpinene-4-ol (3/5%)، -Pinene (2/5%)، b-Pinene (4%)، p-Cymene (7/2%) گزارش شده است.[Verdian-Rizi, 2009 ]
در تحقیقی دیگر، ترکیب های موجود در اسانس برگ، ساقه و میوه برگ بو مورد مطالعه قرار داده شدند. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که ۱,۸-Cineole (2/58 %) ، -Terpinyl acetate (0/10 %)، Sabinene (2/7 %) در اسانس برگ، ۱,۸-Cineole (9/42 %) ، -Terpinyl acetate (8/16 %)، Sabinene (7/4 %) در اسانس ساقه و trans–Ocimene (8/20 %)، ۱,۸-Cineole (4/14 %)، Germacrene B (8/7 %)، -Terpinyl acetate (5/8 %)، -Pinene (6/6 %)، Germacrene D (6 %)، Sabinene (4/5 %) و b-Pinene (1/5 %) در اسانس میوه اجزای اصلی اسانس های هر قسمت بوده اند] نادری حاجی باقر کندی و همکاران، ۱۳۹۰[.
طی پژوهشی دیگر، در ایتالیا اسانس برگ گیاه برگ بو با روش سیال فوق بحرانی استخراج شده است. این روش استخراج در مقایسه با روش تقطیر با آب اختلاف معنی داری از خود نشان نداده و مشخص شده که ۱,۸-Cineole (8/22 %)، Linalool (5/12 %)، -Terpinyl acetate (4/11%) و Methyl eugenol (1/8%) ترکیب های اصلی اسانس استخراج شده می-باشند.
نتایج بدست آمده از آزمایشی تحت عنوان بررسی اسانس موجود در برگ های گیاه برگ بو در مراحل مختلف رشد( رویشی، ابتدای گلدهی، گلدهی و بذر)، نشان داد که بیشترین مقدار اسانس در مرحله گلدهی بدست می آید] [ Verdian-rizi, 2008.
طبق مطالعه ای که بر روی اسانس شاخه، برگ، ساقه و گل برگ بو در Montenegro صورت گرفت، اختلاف معنی داری بین بازده اسانس شاخه، برگ و ساقه مشاهده نشده است. در این تحقیق ترکیباتی نظیر ۱,۸-Cineole ، -Terpinyl acetate، Sabinene ، -Pinene، -Pinene ، Linalool و Methyl eugenol به عنوان ترکیبات اصلی اسانسها گزارش شده-اند .
۲-۴-پژوهش های انجام شده در زمینه ی اندازه گیری فعالیت آللوپاتی گیاهان
در پژوهشی اثر آللوپاتیک غلظت های مختلف اسانس برگ گیاه برگ بو ( L. Laurus nobilis ) بر جوانه زنی، طول نهالها، تعداد برگها، سطح برگها و بیوماس نهالها در دو گیاه velvetleaf (Abutilon theophrastii) و field bindweed (Convolvulus arvensis) بصورت کار گلخانه ای و آزمایشگاهی بررسی گردید. در این پژوهش از غلظت های صفر، ۱۰۰، ۲۰۰، ۳۰۰ و ppm400 اسانس گیاه ( L. Laurus nobilis ) در ظروف پتری- دیش استفاده شد.
نتایج حاصل از این پژوهش نشان دادند با افزایش غلظت بیش از ppm200 اسانس، تمامی فاکتورهای بررسی شده در هر دو گیاه کاهش چشمگیری یافتند. در نتیجه می توان بیان کرد که اسانس برگ گیاه برگ بو ( L. Laurus nobilis ) پتانسیل این را دارد که در برابر دو گیاه velvetleaf (Abutilon theophrastii) و field bindweed (Convolvulus arvensis) به عنوان یک جایگزین مناسب علف کش های تجاری استفاده شود[ Bahram .
پژوهشی به صورت میدانی و آزمایشگاهی به منظور بررسی اثرات آللوپاتی دو گونه ی بومی جنگلهای laurel در جزایر Canary انجام شد. در این پژوهش عصاره ی برگ Laurus azorica و عصاره ی میوه ی Persea indica بر روی طول ریشه چه و ساقه چه ی دو گونه گیاهی یک ساله Lepidium sativum L. (cress) و Lactuca sativa L. (lettuce) مورد ارزیابی قرار گرفت.
در این پژوهش عصاره ی برگ Laurus azorica کاهش معنی داری را هم در طول ساقه چه و هم در طول ریشه چه Lepidium sativum L. (cress) و Lactuca sativa L. (lettuce) نشان داد. عصاره ی میوه ی Persea indica نیز کاهش چشمگیری را در طول ریشه چه ی هر دو گونه مورد بررسی نشان داد.
پس طبق نتایج بدست آمده می توان این گونه عنوان کرد که phytotoxin ها می توانند بطور غیرمستقیم اثرات منفی روی رشد گیاه داشته باشند و در نتیجه ساختار جامعه گیاهی را تغییر دهند[Miamaria, 2005 ].
طی تحقیق دیگری به صورت مجزا اثرات آللوپاتیک اسانس گیاه برگ بو ( L. Laurus nobilis) و دو ترکیب ۱,۸-Cineole و -Pinene که از جمله ترکیبات موجود در اسانس برگ این گیاه معطر می باشند، بر روی ۴ گونه علف هرز Amaranthus retroflexus ، Rumex crispus L. ، Glycyrrhiza glabra L.، Physalis angulata L. و ۳ گونه گیاه زراعی Gossypium hirsitum L. ، Triticum aestivum L. و Zea mays L. در غلظت های مختلف مورد ارزیابی قرار گرفت. این تحقیق نشان داد که اسانس گیاه برگ بو و ترکیبات ۱,۸-Cineole و -Pinene بر روی جوانه زنی بذر علفهای هرز موثر بودند. در مورد گیاهان زراعی نیز با افزایش غلظت ترکیب ۱,۸-Cineole و اسانس گیاه برگ بو، افزایش مهار در جوانه رنی مشاهده شد. با این وجود ترکیب -Pinene در تمام غلظت ها هیچ اثری بر روی جوانه زنی بذر Triticum aestivum L. و Zea mays L. نداشته است. طبق نتایج این تحقیق میتوان چنین برآورد کرد که استفاده از اسانس گیاه برگ بو می تواند راه حل مناسبی برای کنترل علفهای هرز در زمین های کشاورزی باشد.
اهداف پژوهش
با توجه به اهمیت آنتی اکسیدانها و ترکیبات فنلی و از آنجائیکه گیاه برگ بو در طب سنتی همواره مورد استفاده بوده است و امروزه نیز در صنایع دارویی، آرایشی و غذایی کاربرد گسترده-ای دارد، در پژوهش حاضر گیاه برگ بو از جنبه های ذیل مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است:
- تعیین پتانسیل آنتی اکسیدانی عصاره متانولی برگ گیاه برگ بو( Laurus nobilis ) طی مراحل مختلف رشد با بهره گرفتن از ماده ی DPPH
- تعیین درصد مهار رادیکال های آزاد توسط عصاره متانولی برگ گیاه برگ بو
- اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی عصاره متانولی برگ گیاه برگ بو با بهره گرفتن از معرف Folin-ciocalteu
- استخراج و آنالیز اسانس برگ گیاه برگ بو با بهره گرفتن از دستگاه GC/MS
- اثر عصاره ی آبی برگ گیاه برگ بو بر میزان کلروفیل، کاروتنوئید و فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز برگ گیاهچه های گندم و شاهی
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱-جمع آوری و آماده سازی برگهای گیاه برگ بو
شاخه های گیاه برگ بو (Laurus nobilis L.) در مهر ماه ۱۳۹۲ از باغ گیاه شناسی ارم واقع در شیراز جمع آوری شدند. طبق شکل ( ۳-۱ ) این شاخه ها در بالاترین قسمت دارای غنچه و در قسمت میانه دارای میوه بودند. بدین ترتیب در پژوهش حاضر، شاخه های جدا شده از تنه ی اصلی گیاه را طبق داشتن یا نداشتن غنچه و میوه به ۳ قسمت تقسیم کرده ایم ( شکل۳-۲ ).
برگهای جدا شده از قسمت بالای شاخه که دارای غنچه بود را برگهای شاخه غنچه دار، برگهای جدا شده از قسمت میانه شاخه که دارای میوه بود را برگهای شاخه میوه دار و برگهای جدا شده از قسمت پایین شاخه که نه غنچه و نه میوه داشت را برگهای شاخه بدون غنچه و میوه نامیدیم. همانطور که واضح است بالاترین قسمت شاخه، جوان ترین برگها را داشته است.
برگها پس از جداسازی و شستشو، در دمای اتاق به دور از نور مستقیم خورشید به مدت ۵ روز خشک شدند. برگهای این گیاه بعد از خشک شدن، توسط آسیاب برقی به صورت پودر درآورده شد تا برای استخراج بهتر عصاره، سطح تماس آنها با حلال بیشتر شود.
| |
|
|
| الف |
ب |
ج |
| شکل ۳-۲-قسمت های مختلف شاخه برگ بو، شاخه غنچه دار(الف)، شاخه میوه دار(ب)، شاخه بدون غنچه و میوه(ج). |
۳-۲-عصاره گیری
۳-۲-۱-تهیه عصاره متانولی
مقدار یک گرم برگ آسیاب شده وزن و به درون ارلن فویل پیچ شده ریخته شد. سپس با اضافه کردن متانول ۱۰۰ درصد حجم محلول به ۳۰ میلی لیتر رسانده شد. درب ارلن بوسیله ی فویل بسته شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق بر روی shaker قرار داده شد. پس از آن عصاره توسط کاغذ صافی واتمن شماره ی ۱ صاف شد. برای بررسی پتانسیل آنتی اکسیدانی، غلظتهای مختلفی از این استوک (stock) اصلی تهیه گردید.
۳-۲-۲-تهیه عصاره آبی
مقدار یک گرم برگ آسیاب شده وزن و به درون ارلن فویل پیچ شده ریخته شد. سپس با اضافه کردن آب مقطر حجم محلول به ۳۰ میلی لیتر رسانده شد. درب ارلن بوسیله ی فویل بسته شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق بر روی shaker قرار داده شد. بعد از گذشت ۲۴ ساعت محلول هموژنه بدست آمده با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. مایع فوقانی به عنوان استوک (stock) اصلی جدا شد که با افزودن آب مقطر غلظت های مختلفی از آن تهیه گردید.
۳-۳-تعیین پتانسیل آنتی اکسیدانی با بهره گرفتن از روش DPPH
در این روش، آنتی اکسیدان ها با رادیکال آزاد DPPH واکنش داده و آن را کم رنگ یا بی رنگ می کنند که مقدار کاهش رنگ با پتانسیل آنتی اکسیدانی نمونه رابطه ی مستقیمی دارد. تعیین پتانسیل آنتی اکسیدنی با بهره گرفتن از رادیکال آزاد DPPH بر طبق روش توصیف شده توسط Shimada و همکاران (۱۹۹۲) انجام گرفت.
۳-۳-۱-مواد و محلول های مورد نیاز
در این آزمایش از عصاره متانولی برگ گیاه مورد نظر، متانول ۱۰۰ درصد، محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول و محلول استاندارد Trolox استفاده گردید.
۳-۳-۲-روش آزمایش
به منظور اندازه گیری پتانسیل آنتی اکسیدنی عصاره های متانولی برگ گیاهان از محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول استفاده گردید. ابتدا محلول استوک (stock solution) DPPH در متانول بدین صورت تهیه گردید که ۲۴ میلی گرم از پودر رادیکال DPPH توزین و در یک ارلن فویل پیچ شده ریخته شد. سپس ۱۰۰ میلی لیتر متانول ۱۰۰ درصد به آن اضافه گردید. محلول حاصل تا زمان استفاده در دمای C20- نگاهداری شد. برای تهیه محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول، ۱۰ میلی لیتر از محلول استوک را در یک ارلن فویل پیچ شده ریخته و ۴۵ میلی لیتر متانول ۱۰۰ درصد به آن اضافه گردید. محدوده جذب این محلول در طول موجnm 515 می بایست ۰۲/۰ ۱/۱ باشد. در آزمایش-های انجام شده، ۲۸۵۰ میکرولیتر از محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول به درون هر شیشه ریخته شد. سپس ۱۵۰ میکرولیتر از غلظت های مختلف عصاره متانولی برگ گیاه مورد نظر به آن اضافه گردید و به مدت یک ساعت در تاریکی قرار داده شدند. غلظت های مختلف عصاره متانولی با اضافه کردن حجم های مختلف متانول ۱۰۰ درصد به عصاره متانولی اصلی که در قسمت ( ۳-۲-۱ ) توضیح داده شد، تهیه شدند. محلول شاهد (کنترل) فاقد عصاره بود و فقط محتوی ۱۵۰ میکرولیتر متانول ۱۰۰ درصد و ۲۸۵۰ میکرولیتر محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول بود. دستگاه اسپکتروفتومتر توسط متانول۱۰۰ درصد در طول موجnm 515 صفر گردید و پس از آن جذب محلول های شاهد و نمونه ها در طول موج مذکور قرائت شد. در این آزمایش از غلظت های صفر، ۴/۰، ۸/۰، ۲/۱، ۶/۱، ۲، ۴/۲، ۸/۲ و ۲/۳ میلی گرم در میلی لیتر عصاره ی گیاهی استفاده شد. برای هر کدام از غلظت های ذکر شده ۳ تکرار در نظر گرفته شد و میانگین مقادیر جذب خوانده شده در هر غلظت برای رسم منحنی استفاده شد.
۳-۳-۳-تهیه محلول استاندارد
برای تعین پتانسیل آنتی اکسیدانی لازم است منحنی استاندارد رسم گردد. برای این منظور از ترولکس (Trolox) که یک آنتی اکسیدان سنتزی و دارای ساختمانی شبیه به ویتامین E میباشد استفاده گردید. ابتدا محلول استاک (stock solution) 1000 میکرومولار ترولکس در متانول بدین صورت تهیه گردید که ۰۰۱/۰گرم پودر ترولکس در ۴ میلی لیتر متانول ۱۰۰ درصد حل گردید. با اضافه کردن حجم های مختلف متانول۱۰۰ درصد به این محلول غلظت های صفر، ۲۵، ۵۰، ۱۰۰، ۲۰۰، ۳۰۰، ۴۰۰، ۵۰۰، ۶۰۰، ۷۰۰، ۸۰۰ و ۹۰۰میکرومولار ترولکس در متانول تهیه گردید. آنگاه ۱۵۰ میکرولیتر از غلظت های تهیه شده به ۲۸۵۰ میکرولیتر محلول ۰۰۴/۰ درصد DPPH در متانول اضافه گردید. ظرف های شیشه ای حاوی محلول هایی با غلظت های مختلف ترولکس در ۰۰۴/۰ درصدDPPH ، به مدت یک ساعت در تاریکی قرار گرفتند. محلول شاهد (کنترل) فاقد ترولکس بود و فقط محتوی ۱۵۰ میکرولیتر متانول ۱۰۰ درصد و ۲۸۵۰ میکرولیتر محلول ۰۰۴/۰درصد DPPH در متانول بود. پس از صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر توسط متانول ۱۰۰ درصد در طول موجnm 515، جذب محلول های استاندارد در این طول موج قرائت شد. برای هر کدام از غلظت های ذکر شده ۳ تکرار در نظر گرفته شد و میانگین مقادیر جذب خوانده شده در هر غلظت برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد.
با بهره گرفتن از منحنی استاندارد پتانسیل آنتی اکسیدانی برگ گیاه مورد نظر معادل ترولکس برحسب میکرومول ترولکس بازاء گرم وزن خشک تعیین گردید.
به منظور تعیین غلظتی از عصاره متانولی برگ گیاه مورد نظر که ۵۰ درصد رادیکال های DPPH را مهار می کند(IC50)، از نمودارهای مربوط به جذب محلول DPPH در غلظت های مختلف عصاره متانولی هر نمونه گیاهی استفاده گردید.
همچنین درصد مهار رادیکال های DPPH توسط نمونه های گیاهی با بهره گرفتن از فرمول زیر تعیین گردید:
% Inhibition = ( Ablank – Asample ) / Ablank ۱۰۰
Ablank =میزان جذب کنترل
Asample =میزان جذب نمونه
۳-۴-اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی کل (Total Phenolics) با بهره گرفتن از معرف Folin-Ciocalteu
بررسی میزان ترکیبات فنلی کل با بهره گرفتن از Folin-Ciocalteu طبق روش Kim و همکاران (۲۰۰۵) از طریق کاربرد عصاره متانولی برگ گیاهان به صورت زیر انجام گرفت:
۳-۴-۱-مواد و محلول های مورد نیاز
در این آزمایش از عصاره های متانولی برگ گیاه مورد نظر، متانول ۱۰۰ درصد، متانول ۵۰ درصد، معرف Folin-Ciocalteu، محلول بی کربنات سدیم ۶ درصد و محلول استاندارد گالیک اسید استفاده گردید.
۳-۴-۲-روش آزمایش
به منظور اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی کل در عصاره های متانولی برگ گیاهان، از معرف رقیق شده Folin-Ciocalteu استفاده گردید. بدین صورت که درون یک ظرف فویل پیچ شده ۵ میلی لیتر معرف Folin-Ciocalteu ریخته و ۴۵ میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. در نتیجه معرف Folin-Ciocalteu 10 بار رقیق تر شد. این محلول تا زمان استفاده در یخچال نگاهداری شد. به درون هر شیشه ۱۵۰۰ میکرولیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu ریخته شد. سپس ۲۰۰ میکرولیتر از غلظت های مختلف عصاره متانولی برگ گیاه مورد نظر به آن اضافه گردید و به مدت ۵ دقیقه در دمای محیط قرار گرفتند. غلظت های مختلف عصاره متانولی با اضافه کردن حجم های مختلف متانول ۱۰۰ درصد به عصاره متانولی اصلی که در قسمت ( ۳-۲-۱ ) توضیح داده شد، تهیه شدند. سپس ۱۵۰۰ میکرولیتر محلول ۶ درصد (W:V) بی کربنات سدیم، که از طریق حل نمودن ۶ گرم بی کربنات سدیم در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر تهیه شده بود، به لوله های آزمایش اضافه گردید. نمونه ها به مدت ۹۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند. محلول شاهد (کنترل) فاقد عصاره بود و فقط محتوی ۲۰۰ میکرولیتر متانول ۱۰۰ درصد، ۱۵۰۰ میکرولیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu و ۱۵۰۰ میکرولیتر محلول ۶ درصد بی کربنات سدیم بود. جذب دستگاه اسپکتروفتومتر توسط محلول شاهد (کنترل) در طول موجnm 750 صفر گردید و پس از آن جذب محلول های تیمار تهیه شده در طول موج مذکور قرائت شد. در این آزمایش از غلظت های صفر، ۱، ۲، ۳، ۴، ۵، ۶، ۷، ۸، ۹ و ۱۰ میلی گرم در میلی لیتر عصاره-ی گیاهی استفاده شد. برای هر کدام از غلظت های ذکر شده ۳ تکرار در نظر گرفته شد و میانگین مقادیر جذب خوانده شده در هر غلظت برای رسم منحنی استفاده شد.
۳-۴-۳-تهیه محلول استاندارد
برای اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی کل لازم است منحنی استاندارد رسم گردد. برای این منظور از گالیک اسید استفاده شد. محلول استوک (stock solution) 200 میکروگرم در میلی لیتر گالیک اسید بدین ترتیب تهیه شد که ۲ میلی گرم گالیک اسید در ۱۰ میلی لیتر متانول ۵۰ درصد حل گردید. با اضافه کردن حجم های مختلف متانول۱۰۰ درصد به این محلول غلظت-های صفر، ۲۰، ۴۰، ۶۰، ۸۰، ۱۰۰، ۱۲۰، ۱۴۰، ۱۶۰ و ۱۸۰میکروگرم در میلی لیتر گالیک اسید تهیه گردید. آنگاه ۲۰۰ میکرولیتر از غلظت های تهیه شده به لوله های آزمایش محتوی ۱۵۰۰ میکرولیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu اضافه گردید. نمونه ها به مدت ۵ دقیقه در دمای محیط قرار گرفتند و پس از آن ۱۵۰۰ میکرولیتر محلول ۶ درصد بی کربنات سدیم به هر لوله آزمایش اضافه گردید. نمونه ها به مدت ۹۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند.
محلول شاهد (کنترل) فاقد گالیک اسید بود و فقط محتوی ۲۰۰ میکرولیتر متانول ۵۰ درصد، ۱۵۰۰ میکرو لیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu و ۱۵۰۰ میکرولیتر محلول ۶ درصد بی-کربنات سدیم بود که توسط آن جذب دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موجnm 750 صفر گردید. پس از صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر جذب محلول های استاندارد در طول موج مذکور قرائت شد. برای هر کدام از غلظت های ذکر شده ۳ تکرار در نظر گرفته شد و میانگین مقادیر جذب خوانده شده در هر غلظت برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد.
سپس با بهره گرفتن از منحنی استاندارد میزان ترکیبات فنلی کل موجود در برگ گیاه مورد نظر بر حسب میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک محاسبه گردید.
۳-۵-بررسی ترکیبات اسانس برگ گیاه برگ بو
۳-۵-۱-اسانس گیری
به منظور تهیه اسانس مقدار ۱۰۰ گرم برگ خرد شده توزین و در فلاسک دستگاه تقطیر (کلونجر) قرار داده شد. سپس به آن ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر اضافه گردید. فلاسک اسانس گیری پس از آماده شدن بر روی گرم کن برقی قرار داده شد. برای جلوگیری از مخلوط شدن آب و اسانس یک میلی لیتر حلال پنتان در مجرای ذخیره اسانس ریخته شد. با گرم شدن دستگاه، اسانس موجود در برگ همراه آب تبخیر شده به مبرد رسیده و در اثر سرد شدن، بخار آب و اسانس هر دو به حالت مایع در آمده که اسانس در حلال پنتان حل شده ولی آب به علت داشتن چگالی بیشتر از پنتان عبور کرده وارد فلاسک می گردد تا چرخه دوباره تکرار شود. مدت زمان اسانس گیری دو ساعت در نظر گرفته شد. اسانس استخراج شده به شیشه های کوچک درب دار منتقل و اطراف هر شیشه با کاغذ آلومینیومی پوشانده شد و تا زمان انجام آزمایش ها در یخچال نگاهداری شد. در این مرحله بازده تولید اسانس، با تقسیم وزن اسانس بر وزن پودر برگ استفاده شده در اسانس گیری تعیین گردید.
۳-۵-۲-آزمایش های مربوط به تعیین ترکیبات موجود در اسانس برگ گیاه برگ بو
از روش کروماتوگرافی گازی- طیف سنج جرمی (GC/MS) جهت شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ گیاه برگ بو استفاده گردید.
۳-۵-۲-۱-معرفی دستگاه کروماتوگراف گازی متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS)
از دستگاه گاز کروماتوگراف متصل به طیف سنج جرمی Agilent Technologies مدل C5975 استفاده شد که ستون آن HP-5MS به طول ۳۰ متر و قطر داخلی ۲۵/ ۰میلی متر و ضخامت لایه فاز ساکن در آن ۲۵/۰میکرومتر بود. از گاز هلیوم با فشار ورودی یک میلی لیتر در دقیقه به عنوان گاز حامل استفاده شد. درجه حرارت ستون بین ۶۰ تا C 210 برنامه ریزی شد و به تدریج در هر دقیقه C3 به حرارت افزوده شد. سپس افزایش دما تاC 240 با سرعتC 20 در دقیقه انجام گرفت و به مدت ۵/۸ دقیقه در دمای نهایی نگه داشته شد. درجه حرارت آشکارساز C280 و دمای محفظه تزریق نیز C 280 بود. انرژی یونیزاسیون برابر۷۰ الکترون ولت بوده است. محدوده جرمی از ۵۰ تا ۴۸۰ بوده است.
پس از تزریق اسانسها به دستگاه گاز کروماتوگراف متصل شده با طیف سنج جرمی (GC/MS) نهایت طیفهای جرمی و کروماتوگرام های مربوطه ترسیم شدند. سپس با بهره گرفتن از زمان بازداری، شاخص بازداری، مقایسه طیف های جرمی با ترکیب های استاندارد و استفاده از اطلاعات موجود، ترکیب های تشکیل دهنده اسانس ها مورد شناسایی کمی و کیفی قرار گرفت.
۳-۶-بررسی پتانسیل آللوپاتی عصاره آبی گیاه برگ بو
۳-۶-۱-اثر عصاره آبی برگ گیاه برگ بو بر میزان کلروفیل و کاروتنوئید برگ گیاهچه های گندم و شاهی
۳-۶-۱-۱-مواد و محلول های مورد نیاز
در این آزمایش از برگ گیاهچه های ۲۰ روزه، عصاره آبی برگ شاخه غنچه دار گیاه برگ بو، آب مقطر، محلول هیپوکلرید سدیم ۲۰% و استون ۸۰ درصد استفاده گردید.
۳-۶-۱-۲-آماده سازی گیاهان
جهت جلوگیری از رشد قارچ ها ابتدا بذرها در محلول هیپوکلرید سدیم ۲۰% به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده شدند. سپس چند بار با آب معمولی و سرانجام با آب مقطر شسته شدند.
از ظروف کشت به ابعاد ۵ × ۱۴× ۱۸ این آزمایش استفاده شد. ابتدا کف ظروف با مقداری پرلیت پر شد. سپس بذرها بطور کاملا یکنواخت روی پرلیت ها پخش شدند و بار دیگر لایه نازکی از پرلیت روی بذرها ریخته شد. آبیاری با آب مقطر بصورت روزانه و در حد نیاز انجام گرفته شد.
غلظت های ۱۰%، ۲۵% و ۵۰% عصاره آبی برگ شاخه غنچه دار گیاه برگ بو با اضافه کردن حجم های مختلف آب مقطر به عصاره آبی اصلی که طرز تهیه آن در قسمت ( ۳-۲-۲ ) توضیح داده شد، تهیه شدند. پس از جوانه زدن بذرها و بزرگ شدن گیاهچه ها، از روز دهم ۵۰ میلی لیتر عصاره با غلظت های تعیین شده برای هر ظرف، به صورت روزانه به پای ریشه گیاهچه ها تزریق شد و در روز بیستم جهت اندازه گیری مقدار کلروفیل و کاروتنوئید جمع آوری شدند. برای ظرف شاهد نیز فقط از آب مقطر استفاده شد. برای هر غلظت ۳ تکرار در نظر گرفته شد و جمع آوری گیاهچه ها جهت اندازه گیری مقدار کلروفیل و کاروتنوئید به صورت طرح کاملا تصادفی صورت پذیرفت.
۳-۶-۱-۳-روش آزمایش
۲۰۰ میلی گرم از بافت تر برگ توزین و در هاون چینی قرار داده شد. پس از افزودن مقداری استون ۸۰ درصد، قطعات برگ کاملا ساییده شدند. محلول حاصل به درون فالکون ریخته شد و حجم آن با استون ۸۰ درصد به ۲۵ میلی لیتر رسانده شد. محلول حاصل با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ شد. از محلول فوقانی برای اندازه گیری کلروفیل و کاروتنوئید استفاده گردید. بدین ترتیب که جذب محلول تهیه شده، توسط دستگاه اسپکتروفتومتر شیمادزو مدل UV-160A که با استون ۸۰ درصد تنظیم شده بود، در طول موج هایnm ۶۴۵ وnm ۶۶۳ برای کلروفیل[Arnon, 1967] و در طول موج هایnm ۴۱۲، nm431،nm 460 وnm 480 برای کاروتنوئید خوانده شد. میانگین مقادیر جذب بدست آمده طبق طول موج های مربوطه در فرمول های زیر به ترتیب برای محاسبه میزان کلروفیل و کاروتنوئید قرار داده شد:
= ۲۰٫۲ (A645) + 8.02 (A663) × v / f.w. × ۱۰۰۰ (mg/g .f.w) chl.
v =حجم نهایی محلول بر حسب میلی لیتر
f.w. =وزن تر بافت بر حسب میلی گرم
= A جذب اندازه گیری شده در طول موج های نوشته شده
Carotenoids (mg/ml) =
-o.430A ۴۱۲ + ۰٫۲۵۱A ۴۳۱ – ۴٫۳۷۶A ۴۶۰ + ۱۳٫۲۱۶A480
۳-۶-۲-اثر عصاره آبی برگ گیاه برگ بو بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز استخراج شده از برگ گیاهچه های گندم و شاهی
۳-۶-۲-۱-مواد و محلول های مورد نیاز
در این آزمایش از برگ گیاهچه های ۲۰ روزه، عصاره آبی برگ شاخه غنچه دار گیاه برگ بو، آب مقطر، محلول هیپوکلرید سدیم ۲۰%، محلول ۲/۰ مولار گایاکول، محلول ۰۳/۰مولار H2O2، بافر فسفات ۱/۰ مولار با ۶=pH و کلرید پتاسیم (KCl) جامد استفاده گردید.
۳-۶-۲-۲-آماده سازی گیاهان
گیاهچه ها و غلظت های مختلف عصاره مطابق قسمت ( ۳-۵-۱-۲ ) آماده گردید. در این آزمایش از گیاهچه های ۲۰ روزه جهت استخراج آنزیم گایاکول پراکسیداز استفاده شد.
۳-۶-۲-۳-استخراج آنزیم گایاکول پراکسیداز
ابتدا محلول ۸/۰ مولار کلرید پتاسیم به عنوان بافر استخراج بدین صورت تهیه شد که به ۱۰ میلی لیتر محلول بافر فسفات۱/۰ مولار با ۶=pH ، ۶/۰ گرم کلرید پتاسیم اضافه گردید. سپس یک گرم از بافت تر برگ گیاهچه های ۲۰ روزه را توزین و درون هاون چینی با ۱۰ میلی لیتر از بافر استخراج تهیه شده، هموژنه گردید. محلول هموژنه حاصل درون فالکون ریخته شد و با سرعت ۵۰۰۰ دور در دقیقه توسط دستگاه سانتریفیوژ یخچال دار به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ گردید. مایع فوقانی به عنوان عصاره خام حاوی آنزیم گایاکول پراکسیداز مورد استفاده قرار گرفت. این عصاره تا زمان استفاده در یخچال نگاهداری شد. به منظور حفظ فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز، کلیه مراحل ذکر شده در دمایC 4+ (درون ظروف یخ) انجام گرفت.
۳-۶-۲-۴-تعیین فعالیت آنزیم
برای اندازه گیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در گروه های شاهد و تیمار مخلوط واکنش مطابق جدول شماره ( ۳-۱ ) تهیه گردید. تغییرات جذب نور بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتر شیمادزو مدل UV-160A در طول موجnm 436 در فواصل زمانی ۱۵ ثانیه ای برای مدت ۵ دقیقه ثبت و با یکدیگر مقایسه گردید. در این آزمایش برای هر کدام از غلظت های ذکر شده ۳ تکرار در نظر گرفته شد و میانگین مقادیر جذب خوانده شده در هر غلظت برای رسم منحنی استفاده شد.
جدول۳-۱- مخلوط واکنش جهت سنجش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز
| |
بافر استخراج
(ml) |
گایاکول
(M2/0) (l) |
H2O2
(M03/0) (l) |
آنزیم
(l) |
H2O
(l) |
| شاهد(کنترل) |
۳ |
۵۰ |
۵۰ |
— |
۱۰۰ |
| تیمار |
۳ |
۵۰ |
۵۰ |
۱۰۰ |
— |
تجزیه و تحلیل آماری داده ها
کلیه داده ها با بهره گرفتن از برنامه آماری۲۱ SPSS از طریق آزمون چند دامنه ایDuncan و در سطح ۰۵/۰= مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. جهت ترسیم نمودارها و منحنی استاندارد از برنامه Excel 2013 استفاده شد.
فصل چهارم
نتایج
۴-۱-پتانسیل آنتی اکسیدانی برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو با بهره گرفتن از DPPH
شکل ۴-۱ منحنی استاندارد ترولکس بر حسب میکرومول را نشان می دهد. رابطه غلظت های مختلف ترولکس با مقادیر جذب در طول موجnm 515 خطی و R2 برابر ۹۸۱۵/۰ می باشد. از این منحنی به منظور ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی نمونه ها بر حسب میکرومول ترولکس به ازاء گرم وزن خشک گیاه استفاده گردیده است.
نتایج مربوط به فعالیت آنتی اکسیدانی غلظت های مختلف عصاره متانولی با جذب در طول موجnm 515 در شکل ۴-۲ نشان داده شده است. رابطه (correlation) بین غلظت های مختلف عصاره ی هر قسمت با مقادیر جذب در طول موج فوق خطی و R2 بین ۹۸۴۶/۰الی ۹۹۴۲/۰درصد می باشد.
در جدول ۴-۱ پتانسیل آنتی اکسیدانی عصاره ها بر حسب میکرومول ترولکس بر گرم وزن خشک، مقادیر IC50 برحسب میلی گرم در میلی لیتر و درصد مهار رادیکال های DPPH توسط عصاره متانولی برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو منعکس گردیده است. همان گونه که در جدول ۴-۱ مشخص شده است پتانسیل آنتی اکسیدانی بین ۸۵۶/۱ ± ۶۷/۴۰ تا ۳۳۳/۰ ± ۶۷/۵۹ میکرومول ترولکس بر گرم وزن خشک می باشد. بیشترین پتانسیل آنتی اکسیدانی مربوط به برگهای شاخه غنچه دار برگ بو (µmol g-1 DW 333/0 ± ۶۷/۵۹ ) می باشد و پس از آن به ترتیب برگ های شاخه بدون میوه و غنچه (µmol g-1 DW 882/0 ± ۶۷/۵۴ ) و سپس برگ های شاخه میوه دار (µmol g-1 DW 856/1 ± ۶۷/۴۰) قرار گرفته اند. همان طور که مشخص است کمترین پتانسیل آنتی اکسیدانی مربوط به برگ های شاخه میوه دار می باشد. از نظر آماری در پتانسیل آنتی اکسیدانی برگ قسمتهای مختلف شاخه گیاه برگ بو اختلاف معنی دار در سطح ۰۵/۰ = مشاهده می شود.
طبق جدول ۴-۱ محدوده مقادیر IC50 بین ۰۱۳/۰ ± ۰۱/۲ تا ۰۵۹/۰ ± ۷۲/۲ میلی گرم در میلی لیتر می باشد. کمترین مقدار IC50 مربوط به برگ های شاخه غنچه دار برگ بو می باشد که مسلماً بیشترین پتانسیل آنتی اکسیدانی را نسبت به برگ های دیگر به خود اختصاص داده است. از نظر آماری بین مقادیر IC50 برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو اختلاف معنی داری در سطح ۰۵/۰= مشاهده می شود.
همچنین مقادیر مربوط به درصد مهار رادیکال های DPPH در جدول ۴-۱ از ۴۴۳/۱ ± ۱۳/۳۵ تا ۱۱۶/۰ ± ۲۰/۴۹ می باشد. بالاترین درصد مهار رادیکال های DPPH به برگ های شاخه غنچه دار برگ بو اختصاص دارد و پس از آن برگ های شاخه بدون میوه و غنچه و برگهای شاخه میوه دار به ترتیب در رده های پایین تر قرار می گیرند. مقادیر درصد مهار رادیکالهای DPPH توسط عصاره متانولی برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو اختلاف معنی داری را در سطح ۰۵/۰ = نشان می دهد.
| |
| شکل ۴-۱- منحنی استاندارد ترولکس بر حسب میکرومول |
| الف |
| |
| ب |
| |
| ج |
| |
| شکل ۴-۲-اثر غلظت های مختلف (mg ml-1 ) عصاره متانولی برگ های شاخه غنچه دار(الف)، برگ های شاخه میوه دار(ب) و برگ های شاخه بدون میوه و غنچه(ج) بر جذب محلول DPPH. |
جدول ۴-۱ پتانسیل آنتی اکسیدانی بر حسب میکرومول ترولکس بر گرم وزن خشک، مقادیر IC50 بر حسب میلی گرم در میلی لیتر و درصد مهار رادیکالهای آزاد DPPH توسط عصاره ی برگ های شاخه.
|
| برگ های قسمت های مختلف شاخه |
Trolox equivalents (µmol g-1 DW) |
IC50(mg ml-1) |
% Inhibition of DPPH |
| غنچه دار |
۵۹٫۶۷ ± ۰٫۳۳۳ a |
۲٫۰۱ ± ۰٫۰۱۳ a |
۴۹٫۲۰ ± ۰٫۱۱۶ a |
| میوه دار |
۴۰٫۶۷ ± ۱٫۸۵۶ b |
۲٫۷۲ ± ۰٫۰۵۹ b |
۳۵٫۱۳ ± ۱٫۴۴۳ b |
| بدون میوه و غنچه |
۵۴٫۶۷ ± ۰٫۸۸۲ c |
۲٫۲۳ ± ۰٫۰۴۵ c |
۴۴٫۸۷ ± ۰٫۷۵۴ c |
|
* حروف متفاوت در هر ستون براساس آزمون دانکن دارای اختلاف معنی دار ( ۰۵/۰= ) می باشند. هر عدد میانگین سه تکرار ± (standard error ) می باشد. DW: وزن خشک.
۴-۲- میزان ترکیبات فنلی کل (Total Phenolics) با بهره گرفتن از معرف Folin-Ciocalteu
منحنی استاندارد گالیک اسید بر حسب میکروگرم در میلی لیتر در شکل ۴-۳ نشان داده شده است. رابطه غلظت های مختلف گالیک اسید با مقادیر جذب در طول موجnm 750 خطی و R2 برابر ۹۹۶۸/۰ می باشد. از این منحنی برای اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی نمونه ها بر حسب میلی گرم گالیک اسید به ازاء گرم وزن خشک استفاده گردیده است.
نتایج مربوط به رابطه ی غلظت های مختلف عصاره متانولی برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو برحسب میلی گرم بر میلی لیتر با جذب در طول موج nm 750 در شکل ۴-۴ نشان داده شده است. رابطه (correlation) بین غلظت های مختلف عصاره ی هر قسمت با مقادیر جذب در طول موج فوق خطی و R2 بین ۹۹۵۰/۰ الی ۹۹۷۴/۰ می باشد.
در جدول ۴-۲ میزان ترکیبات فنلی کل در عصاره ها بر حسب میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک نشان داده شده است. میزان ترکیبات فنلی کل در عصاره ها بین ۰۴۵/۰ ± ۵۶/۵ تا ۱۳۹/۰ ± ۲۲/۱۲ میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک می باشد. بیشترین میزان ترکیبات فنلی کل مربوط به برگهای شاخه بدون میوه و غنچه برگ بو ( mg GAE g-1 DW139/0 ± ۲۲/۱۲ ) می باشد و پس از آن به ترتیب برگهای شاخه غنچه دار ( mg GAE g-1 DW012/0 ± ۷۶/۵) و سپس برگ های شاخه میوه دار ( mg GAE g-1 DW045/0 ± ۵۶/۶ ) قرار گرفته اند. همان طور که مشخص است کمترین میزان ترکیبات فنلی کل مربوط به برگهای شاخه میوه دار می-باشد. مقادیر ترکیبات فنلی کل در برگهای قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو دارای اختلاف معنی دار در سطح ۰۵/۰ = میباشد.
| |
| شکل ۴-۳- منحنی استاندارد گالیک اسید برحسب میکروگرم درمیلی لیتر |
الف
ب
ج
شکل ۴-۴-میزان جذب معرف Folin-Ciocalteu در غلظت های مختلف(mg ml-1 ) عصاره متانولی برگهای شاخه غنچه دار(الف)، برگ های شاخه میوه دار(ب) و برگ های شاخه بدون میوه و غنچه(ج).
جدول ۴-۲ میزان ترکیبات فنلی کل عصاره ی متانولی برگ های شاخه بر حسب میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک.
|
| برگ های قسمت های مختلف شاخه |
Total Phenols (mg GAE g-1 DW) |
| غنچه دار |
۵٫۷۶ ± ۰٫۰۱۲ a |
| میوه دار |
۵٫۵۶ ± ۰٫۰۴۵ a |
| بدون میوه و غنچه |
۱۲٫۲۲ ± ۰٫۱۳۹ b |
|
* حروف متفاوت در هر ستون براساس آزمون دانکن دارای اختلاف معنی دار ( ۰۵/۰= ) می باشند. هر عدد میانگین سه تکرار ± ( standard error ) می باشد. :GAE گالیک اسید؛ DW: وزن خشک.
۴-۳-مقایسه بازده اسانس برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو
اسانس گیری از برگ ها با بهره گرفتن از دستگاه کلونجر صورت گرفت. همانطور که جدول ۴-۳ نشان می دهد برگ های شاخه غنچه دار برگ بو با ۵۳/۱درصد (۵۳/۱ گرم بازاء ۱۰۰ گرم وزن خشک برگ) بیشترین بازده را دارا بوده است.
جدول ۴-۳- بازده اسانس برگ های قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو
|
| بازده اسانس ( % ) (W/W) |
برگ های قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو |
| ۵۳/۱ |
غنچه دار |
| ۴۰/۱ |
بدون غنچه و میوه |
| ۳۰/۱ |
میوه دار |
۴-۴-شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ گیاه برگ بو
با بهره گرفتن از روش GC/MS شناسایی ترکیبات اسانس برگ قسمت های مختلف شاخه گیاه برگ بو صورت پذیرفت.
۴-۴-۱-شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو
در اسانس برگ های شاخه غنچه دار گیاه برگ بو ۵۴ ترکیب شناسایی شد که جمعا ۲۶/۹۹ درصد از حجم اسانس را تشکیل می دهند( جدول ۴-۴ ). ترکیبات ۱,۸-Cineole با ۹۹/۲۶ درصد، -Terpinyl acetate با ۷۷/۱۷ درصد و Sabinene با ۴۲/۸ درصد در مجموع ۱۸/۵۳ درصد از کل ترکیبات اسانس را تشکیل می دهند. ترکیبات Tricyclene با ۰۳/۰درصد، (Z)–Ocimene با ۰۲/۰درصد و (E)–Ocimene با ۰۲/۰ درصد نسبت به سایر ترکیبات مقدار کمتری از حجم اسانس را تشکیل می دهند. ترکیبات متشکله اسانس به همراه درصد و شاخص بازداری در جدول ۴-۴ و کروماتوگرام اسانس نیز در شکل ۴-۵ نشان داده شده است.
۴-۴-۲-شناسایی ترکیبات موجود در اسانس برگ های شاخه میوه دار گیاه برگ بو
در اسانس برگ های شاخه میوه دار گیاه برگ بو ۵۴ ترکیب شناسایی شد که جمعا ۵۱/۹۹ درصد ازحجم اسانس را
