شکل ۲-۳- ساختار اسید سالیسیلیک
یکی دیگر از مشتقات اسید سالیسیلیک متیل سالیسیلات است که در اتمسفر توسط گیاهان جذب می­ شود و در سیگنال­های ارتباطی بین سلول­ها، گیاهان و حیوانات و میکروارگانیسم­ها شرکت می­ کنند. همچنین، متیل سالیسیلات به عنوان یک سیگنال آندروژن گیاهی باعث افزایش مقاومت گیاه به تنش­هایی از قبیل سرما، گرما، شوری و خشکی می­ شود (لیسیآ و همکاران ، ۲۰۰۵).

۲-۱۱-۲- متابولیسم اسید سالیسیلیک

سالیسیلیک اسید (۲- هیدروکسی بنزوئیک اسید) به­ وسیله آمینواسیدی به نام فنیل آلانین به صورت زیستی سنتز می­ شود. روش زیر که به روش کولبه – شمت معروف است نیز راه ساختن تجاری این ماده است (شکل ۲-۴). از اسیدی کردن سدیم سالیسیلات بوسیله اسید سولفوریک، سالیسیلیک اسید حاصل می شود.
شکل ۲-۴-سنتز تجاری سالیسیلیک اسید
کمترین مقدار گلیکوزیدهای اسید سالیسیلیک در برگ وجود دارد. اسید سالیسیلیک به وسیله سلول­های ریشه و میکروارگانیسم­های مختلف تولید شده و به اشکال مختلف در هوا، سطح برگ و اطراف سلول­های ریشه وجود دارد. اسید سالیسیلیک تولید شده نقش محوری در تنظیم مراحل مختلف مانند رشد و تکامل گیاه، جذب یون، فتوسنتز و جوانه­زنی ایفامی­کند (ال – تآیب ، ۲۰۰۵).
روش­های افزایش مقاومت گیاهان به تنش­های محیطی شامل روش­های اصلاحی و مهندسی ژنتیک و استفاده از مواد تنطیم کننده رشد گیاهی^[۲۱] (PGRs) می­باشد. تنظیم کننده­ های رشد گیاهی به طور وسیع در محصولات کشاورزی به عنوان عاملی برای بهبود عملکرد محصولات به­کار برده می­شوند و اغلب برای افزایش مقاومت گیاهان به تنش­ها استفاده می­شوند. گزارش­های موفقی از کاربرد برخی از این مواد در مقابله با اثرات نا­مطلوب تنش بر گیاهان ارائه شده است (قربانی جاوید و همکاران ، ۲۰۱۱). اسید سالیسیلیک یک تنظیم کننده رشد درونی از گروه ترکیبات فنلی طبیعی می­باشد که در تنظیم فرایند­های فیزیولوژیکی گیاه نقش دارد. القای گلدهی، رشد و نمو، سنتز اتیلن، تاثیر در باز و بسته شدن روزنه­ها و تنفس از نقش­های مهم اسید سالیسیلیک به شمار می­رود (رآسکین ، ۱۹۹۲) . اسید سالیسیلیک در گیاهانی که تحت تنش هستند نقش حفاظتی دارد. این ترکیب سبب افزایش مقاومت به تنش شوری در گیاه فلفل (چانگلی و چانیو، ۲۰۱۲؛ دیپاسکال و همکاران ،۲۰۰۳)، تنش خشکی در گیاه برنج (فاروق و همکاران ، ۲۰۰۹) ، تنش سرما و گرما در گوجه فرنگی و لوبیا (سینآرآتنا و همکاران ، ۲۰۰۰) و تنش عناصر سنگین در جو (مت والی و همکاران ، ۲۰۰۳) شده است. مکانیسم عمل اسید سالیسیلیک در برابر تنش­ها به نقش آن در تنظیم آنزیم­ های آنتی اکیسدانی و ترکیبات دارای گونه­ های اکسیژن فعال در گیاه برمی­گردد. اسید سالیسیلیک از طریق افزایش فعالیت آنزیم­ های آنتی اکسیدانت، گیاهان را از صدمات بدست آمده از واکنش­های اکسیداتیو حفظ می­ کند(قربانی جاوید و همکاران ، ۲۰۱۱). اسید سالیسیلیک در غلظت ۲ میلی مولار به مدت ۱۶ هفته نگهداری باعث حفظ سفتی بافت میوه کیوی رقم هایوارد شده است و تاثیر معنی داری بر میزان اسیدهای آلی و فعالیت آنتی اکسیدانی آن داشته است (روحی و همکاران ، ۱۳۹۱). بر اساس نتایج سالیسیلیک اسید در غلظت های ۱۵۰، ۳۰۰، ۴۵۰ میلی گرم در لیتر به مدت ۵ دقیقه غوطه وری بر کنترل پوسیدگی، حفظ کیفیت پس از برداشت و عمر انباری نارنگی رقم کینو، مؤثر بود. این ماده در غلظت های بالا باعث افزایش پوسیدگی و کاهش وزن شد. نشت یون را نسبت به شاهد کاهش داد و باعث بالا ماندن میزان ویتامین ث نسبت به شاهد گردید (فرهمندیان و همکاران ،۱۳۹۱). تاثیر اسید سالیسیلیک بر کم شدن خسارت سرما در هلو در طی دوره انبار، به توانایی آن در تحریک سیستم آنتی اکسیدانی و تولید پروتئین های شوک حرارتی نسبت داده شده است. کاربرد اسید سالیسیلیک در هویج تحت تنش شوری عامل افزایش مقدار کارتنوئیدهای کل ریشه و همچنین آنتوسیانین و فعالیت آنتی اکسیدانی و سبب تنظیم تجمع پروتئین ها شد (ارآسلان و همکاران ، ۲۰۰۷). برخی کاربرد­­های این ماده در گیاهان دارویی نیز گزارش شده است که عمداً مربوط به اثر این ماده در کاهش تنش­ها و افزایش اسانس در این گیاهان بوده است.

۲-۱۲- تراکم گیاهی

شناخت عوامل مؤثر بر عملکرد و محدودیت­هایی که برای دستیابی به عملکردهای بالاتر در محصولات زراعی وجود دارد، می ­تواند اقدامی مؤثر در تولید ارقام سازگار و پر محصول باشد (نادری درباغ شاهی و همکاران، ۱۳۸۳). یکی از پیش شرط­های لازم برای دستیابی به عملکرد بالا، تأمین شرایط مطلوب جهت استفاده از تابش خورشیدی در بالاترین حد کارایی آن به منظور تولید مواد فتوسنتزی است (بهشتی و همکاران، ۱۳۸۱). دستیابی به این هدف با تغییر تراکم بوته و توزیع بوته­ها در واحد سطح زمین میسر می­ شود. اثر توزیع یکنواخت بوته در واحد سطح بر توزیع مناسب نور دریافتی در درون پوشش گیاهی نمایان می­ شود. بنابراین اثر آرایش کاشت و تراکم گیاهی بر محصول، عمدتاً به علت تفاوت در چگونگی جذب انرژی تابشی خورشید است و افزایش جذب تابش خورشیدی منجر به افزایش عملکرد می­ شود (فتحی، ۱۳۸۴). عملکرد کل ماده خشک نتیجه کارآیی جامعه گیاهی از نظر استفاده از تابش خورشید در طول فصل رویشی است، در این ارتباط جامعه گیاهی نیاز به سطح برگ کافی دارد که یکنواخت توزیع شده باشد و سطح زمین را کاملاً بپوشاند. بنابراین یکی از مهمترین وظایف مدیریت مزرعه انتخاب تراکم بوته و آرایش مناسب کاشت جهت جذب حداکثر تابش خورشیدی است (اوزونی دوجی و همکاران، ۱۳۸۶).
مواد مؤثره اگرچه اساساً با هدایت فرآیندهای ژنتیکی ساخته می­شوند، ولی تولید آنها به طور بارزی تحت تأثیر عوامل محیطی قرار می­گیرد، به طوریکه عوامل محیطی سبب بروز تغییراتی در رشد و نمو گیاهان دارویی و نیز کمیت وکیفیت مواد مؤثره آنها می­ شود (امیدبیگی، ۱۳۷۴؛ دآنتونو و همکاران، ۲۰۰۲). تراکم اثرات بسیار زیادی بر عملکرد محصول در گیاهان دارویی دارد و همچون سایر تکنیک­های مدیریت کشاورزی بااهمیت می­باشد(حیدری و همکاران، ۱۳۸۷).
بنابراین، با توجه به اینکه یکی از عوامل مؤثر بر عملکرد، تراکم بوته است، لذا با توجه به محدودیت ظرفیت محیط کشت باید از تراکمی استفاده نمود که جمعیت گیاهی علاوه بر تأمین نیاز از منابع محیطی (نور و آب) باکمترین رقابت درون گونه ­ای مواجه باشد (خزاعی و همکاران، ۱۳۸۶). تراکم مطلوب گیاه که طی آن بیشترین کارایی استفاده از نور و حداکثر رشد اتفاق می­افتد از مهمترین اهداف در مدیریت زراعی است (نبوی کلات و همکاران، ۱۳۸۴). به عبارتی در صورتی که از حداکثر انرژی خورشید حداکثر استفاده به عمل آید، کارایی مصرف نور افزایش یافته و با نفوذ نور در لایه­ های مختلف کانوپی، فتوسنتز، زیست­توده تولیدی و عملکرد افزایش می­یابد و شرایط برای آفات و بیماری­ها نامساعد می­ شود (قلی بیگیان و همکاران، ۱۳۸۸). اگر میزان تراکم بوته بیش از حد بهینه باشد عوامل محیطی موجود از جمله رطوبت، نور و مواد غذایی در حد بهینه در اختیار هر بوته قرار نمی­گیرد و برعکس چنانچه تراکم بوته کمتر از حد مطلوب باشد از امکانات محیطی موجود به نحو مطلوب استفاده نمی­ شود که خود باعث کاهش محصول می­گردد (نوروزپور و رضوانی مقدم، ۱۳۸۵).
تحقیقات انجام شده روی گیاه دارویی سیاهدانه نشان داد که افزایش تراکم بوته در واحد سطح بیش از حد مطلوب، منجر به کاهش عملکرد و مقدار ماده مؤثره می­ شود (نوروز پور و رضوانی مقدم، ۱۳۸۵). امانتایج به­ دست آمده درخصوص اسفرزه (خزاعی و همکاران، ۱۳۸۶)، ریحان (دادوند سراب و همکاران، ۱۳۸۷)، بابونه آلمانی (حمزه ای و همکاران، ۱۳۸۵) و زیره سبز (میر شکاری، ۱۳۸۵) کاملاً متفاوت بود و با افزایش تراکم، عملکرد دانه نیز افزایش یافت. نتایج حاصل از پژوهش بریماوندی و همکاران (۲۰۱۱) روی همیشه بهار نشان داد که تأثیر تراکم بر وزن خشک تک بوته، تعداد گل در بوته، تعداد شاخه جانبی، وزن خشک گل و مقدار اسانس در۱۰۰ گرم گل معنی­دار بود، به طوری­ که با افزایش تراکم، از ۲۰ به۸۰ بوته در مترمربع، همه شاخص­ های ذکر شده کاهش نشان داد، در حالی­که بیشترین عملکرد بیولوژیک و عملکرد اسانس در واحد سطح در تراکم ۶۰ بوته در متر مربع حاصل شد.

۲-۱۳-پیشینه علمی تحقیق

با توجه به مرور منابع انجام گرفته گزارش­های اندکی در مورد اثر سالیسیلیک اسید و تراکم گیاهی بر کمیت و کیفیت مرزه خصوصاً گونه بختیاری موجود می­باشد.
شاهیوند (۱۳۹۱) در آزمایشی اثر تراکم گیاهی و دور آبیاری را بر روی گیاه مرزه بختیاری مورد بررسی قرار داد. نتایج نشان داد که بیشترین وزن تر وخشک در تیمار آبیاری هر روز و فاصله کشت ۱۵*۱۵ سانتی­متر به دست آمد. بیشترین میزان تولید اسانس در فواصل آبیاری ۴ روز یک بار و فاصله کشت ۲۰*۲۰ سانتی­متر به دست آمد. بازدهی اسانس در تیمارهای مختلف ۳۰% تا ۸۷% متغیر بود. عمده ترین ترکیب اسانس این گیاه تیمول بود که بیشترین مقدار آن در ترکیب تیماری آبیاری ۴ روز یکبار و تراکم ۲۰*۲۰ سانتی­متر ثبت گردید و پس از تیمول به ترتیب گاماترپینن، ترانس کاریوفیلن، لینالول و پی سیمن عمده­ترین ترکیبات اسانس این گیاه بودند.
حیاتی و همکاران (۱۳۹۰) در بررسی اثر سالیسیلیک اسید (۰، ۲۰۰، ۴۰۰ و ۶۰۰ پی پی ام) بر خصوصیات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی گیاه دارویی مرزه به این نتیجه رسیدند که سالیسیلیک اسید سبب افزایش ارتفاع، وزن تر و خشک، ارتفاع شاخه های جانبی، طول شاخه های جانبی و میزان اسانس را افزایش داد. در این تحقیق غلظت ۲۰۰ پی پی ام بیشترین تاثیر را در افزیش درصد اسانس داشت. اسکندری (۲۰۰۱) تاثیر ۲۸-هموبراسینولید در کاهش اثرات تنش خشکی را در گیاه مرزه مورد بررسی قرار داد. در این تحقیق فاکتور تنش خشکی در سه سطح، آبیاری در حد ظرفیت مزرعه (FC)، تنش ملایم (دوسوم FC) و تنش شدید (یک سومFC) وچهار غلظت ماده تنظیم کننده رشد گیاهی ۲۸-هموبراسینولید،صفر، M^10-10 ، M^8-10 و ^۶-۱۰ مولاراعمال گردید. نتایج به­دست آمده نشان داد که کاهش آبیاری تأثیر معنی­داری در کاهش پارامترهای رشدی شامل وزن خشک و طول ریشه، قطر ساقه، تعداد شاخه­ های فرعی، ارتفاع گیاه، عملکرد کل اندام هوایی و عملکرد اسانس داشت. استفاده از غلظت ^۸-۱۰ مولار ۲۸-هموبراسینولید موجب افزایش معنی­دار وزن خشک ریشه، قطر ساقه، تعداد شاخه فرعی، ارتفاع گیاه، عملکرد کل و عملکرد اسانس شد. درصد اسانس با کاهش آبیاری، افزایش معنی­داری را در سطح ۱% نشان داد به­ طوری که درصد اسانس از ۳۶% در تیمار آبیاری کامل، به ۸۷% درتنش شدید و استفاده از ^۸-۱۰ مولار هورمون ثبت گردید. عملکرد اسانس در سطح ۵% تحت تاثیر آبیاری و کاربرد هورمون قرار گرفت و بیشترین عملکرد اسانس مربوط به آبیاری کامل و استفاده از ^۸-۱۰ مولار ۲۸-هموبراسینولید و با مقدار ۳۲/۲۹ کلیوگرم در هکتار بدست آمد. در این مطالعه استفاده از این سطح هورمون در آبیاری کامل، تنش ملایم و شدید به­ترتیب باعث افزایش معنی­دار ۵۹، ۳۰ و ۲۴ درصدی عملکرد اسانس نسبت به گیاهان شاهد گردید. به­ طور کلی نتایج حاصل از آزمایش نشان داد که استفاده از ۲۸-هموبراسینولید از طریق تحریک افزایش پارامترهای رشد و عملکرد ماده خشک مرزه باعث افزایش عملکرد اسانس این گیاه شده و راهکار مناسبی برای مقابله با شرایط تنش آبی می­باشد.
طی یک تحقیق اثر برهمکنش سالیسیلیک اسید، آسکوربیک اسید و تنش خشکی بر برخی پارامترهای بیولوژیکی مرزه مورد بررسی قرار گرفت . در این تحقیق تیمار آبیاری در سطوح بدون تنش، دوسوم و یک سوم ظرفیت مزرعه و تیمار سالیسیلیک اسید و آسکوربیک اسید در غلظت­های صفر، ۱و ۳ میلی­مولار به­کار گرفته شد. نتایج نشان دادکه تحت تنش خشکی، مقدار قند و پروتئین مرزه کم شد ولی میزان پرولین و پراکسیداسیون لیپیدها افزایش یافت. طبق نتایج وقتی تنش خشکی روی گیاه اثر می­گذارد مکانیسم­های حفاظتی فعال می­شوند. کاهش میزان پروتئین در این شرایط نشان می­دهد که تنش خشکی سنتز پروتئین­ها را تحت تأثیر قرار می­دهد و باعث کاهش آن می­ شود و کاهش قند نیز نشان می­دهد که تنش روی فتوسنتز اثر می­گذارد. از طرف دیگر کاربرد سالیسیلیک اسید و آسکوربیک اسید در این شرایط تنش اثرات نامطلوب تنش آبی را کم کرده و برخی پارامتر­های رشدی را افزایش می­دهد (یزدان پناه و همکاران، ۲۰۱۱).
فصل سوم
مواد و روش‌ها

۳-۱- زمان و موقعیت محل اجرای آزمایش

این تحقیق در سال‌۱۳۹۲ در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام با عرض جغرافیایی ۳۳ درجه و ۳۹ دقیقه شمالی و طول جغرافیایی ۴۶ درجه و ۲۲ دقیقه شرقی و ارتفاع ۱۴۴۶ متر از سطح دریا اجرا شد.
عملیات آزمایشگاهی مانند استخراج اسانس در آزمایشگاه‌های دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام با بهره گرفتن از دستگاه کلونجر و آنالیز اسانس‌ها برای شناسایی اجزای آن‌ ها به وسیله دستگاه‌های GC و GC-MS در پژوهشکده گیاهان دارویی، دانشگاه شهید بهشتی انجام شد.

۳-۲- عملیات آماده سازی زمین

زمین مورد نظر به مساحت ۴۰۰ متر مربع در پاییز ۱۳۹۰ مشخص شد. عملیات خاک­ورزی اولیه در طول زمستان ۱۳۹۰ انجام گرفت و سپس کرت‌ها مشخص شدند. طرح آزمایشی شامل سه بلوک بود که هر بلوک شامل ۸ کرت و ابعاد کرت‌ها ۵۰×۵۰ سانتی­متر بود. فاصله بین کرت‌ها در هر بلوک یک و نیم متر و فاصله بین بلوک‌ها ۲ متر بود.

۳-۳- مشخصات خاک محل انجام آزمایش

جهت بررسی خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک، از مزرعه تحقیقاتی تا عمق ۳۰ سانتی‌متری خاک نمونه گیری شد. نمونه­ها در سایه خشک شده، خاک توسط هاون چینی کوبیده شد و کلوخه‌های آن خرد شدند. سپس با الک دو میلی‌متری سرند شده و برای انجام آزمایش‌های خاک آماده شدند(افتخار، ۱۳۸۳).

۳-۳-۱- تعیین بافت خاک

برای تعیین بافت خاک از روش هیدرومتری استفاده شد. برای این منظور ۵۰ گرم خاک نرم داخل بشر ریخته و تا نصف آب مقطر و سپس ۱۰ سی سی هگزامتافسفات سدیم افزوده و به مدت ۵ دقیقه به هم زده شد و این کار به مدت ده دقیقه ادامه داشت. مخلوط خاک و آب را داخل استوانه مندرج به حجم یک لیتر رسانده شد. پس از هم‌زدن دوباره هیدرومتر را داخل استوانه مندرج گذاشته و قرائت اول بعد از ۴۰ ثانیه پس از هم زدن یادداشت شد که نشان دهنده رس و سیلت است. قرائت دوم پس از دو ساعت از هم زدن است که مقدار رس را نشان می‌دهد. با تعیین میزان درصد رس، سیلت و شن با کمک مثلث بافت خاک تعیین می‌شود.

۳-۳-۲- اندازه‌گیری pH،EC و درصد مواد آلی خاک

پس از تهیه گل اشباع، برای تعیین pH خاک از دستگاه pH متر استفاده شد. برای تعیینEC خاک از دستگاه هدایت الکتریکی و برای اندازه‌گیری ماده آلی خاک از روش والکی و پلاک استفاده شد.

۳-۳-۳- اندازه‌گیری فسفر خاک

برای اندازه‌گیری میزان فسفر خاک از روش السون (۱۹۹۴) که مبنای عصاره گیری در این روش بارگیری محلول ۵/۰ نرمال بی کربنات سدیم با۵/۸pH= است استفاده شد.

۳-۳-۴- اندازه‌گیری میزان پتاسیم خاک

پتاسیم (K) از روش عصاره گیری با استات آمونیوم اندازه‌گیری شد. عصاره‌های بدست آمده طی سه مرحله را با استات آمونیوم به حجم ۱۰۰ میلی­لیتر رسانده و سپس محلول توسط دستگاه فلیم فتومتر قرائت گردید.
جدول۳-۱- مشخصات خاک محل انجام تحقیق