ای در بیوسنتز کوآنزیم­ها می­باشد. اگر چه همه مایکوباکتریوم­ها تولید نیکوتینیک اسید می­ کنند، اما مطالعات نشان داده که بدلیل متوقف شدن و مسدود شدن راه متابولیکی،M. tuberculosis مقدار زیادی از نیاسین را در خود انباشته می­ کند و این انباشتگی در تعیین و تشخیص این گونه­ ها مفید واقع می­ شود. این آزمایش درM. tuberculosi نبایستی هیچ­وقت برای شناسایی و افتراق آنها صورت بگیرد زیرا گونه­ های دیگری از مایکوباکتریوم­ها از قبیل مایکوباکتریوم سیمیه (Simiae) و چلونه­ای و برخی از نژادهای BCG همیشه دارای نتایج مثبت از این تست خواهند بود. احیا نیترات و کاتالاز ۶۸ درجه تاییدی بر افتراق و شناساییM. tuberculos می­باشند. واکنشی رنگی صورتی مثبت تلقی می­شد.
۳-۵-۱-۱٫ معرف­ها و مواد لازم تست نیاسین
معرف­ها: آنیلین ۴% (یا بنزیدین ۱۰%) و برومید سیانوژن ۱۰%
مواد لازم: اتانول ۹۵% برای تهیه آنیلین، آب مقطر استریل یا سالین ۸۵/۰ درصد
۳-۵-۱-۲٫ آماده ­سازی محلول­های نیاسین
بنزیدین ۱۰ درصد

• ۱۰ گرم از بنزیدین در آب مقطر استریل حل ­شد و در یک شیشه قهوه­ای رنگ که نور از آن عبور نمی­کرد در یخچال نگهداری ­گردید (اگر محلول به رنگ زرد تغییر رنگ پیدا می­کرد، دور ریخته می­شد).

برومید سیانوژن ۱۰ درصد

• ۵ گرم از برومید سیانوژن در ۵۰ میلی­لیتر از آب مقطر حل ­گردید و محلول در یک شیشه قهوه­ای رنگ که نور از خود عبور نمی­داد و دارای در کاملا” سفت و محکم بود در یخچال نگهداری شد.

سالین ۸۵/۰ درصد

• ۸۵/۰ گرم از سدیم کلراید در ۱۰۰ میلی­لیتر از آب مقطر حل و اتوکلاو ­شد.

۳-۵-۱-۳٫ مراحل کارتست نیاسین

• ۱ میلی­لیتر از آب مقطر استریل یا سالین ۸۵/۰ درصد به محیط کشت مورد استفاده افزوده شد و لوله­ها بصورت افقی قرار ­گرفت تا مایع افزوده شده کاملا” سطح محیط را ­پوشاند.
• برای خروج نیاسین، لوله­ها حداقل ۳۰ دقیقه در وضعیت افقی قرار ­گرفتند.
• به لوله فوق ۵/۰ میلی­لیتر بنزیدین و ۵/۰ میلی­لیتر برومید سیانوژن اضافه ­شد (Kubica G and Kent P., 1985).

۳-۵-۲٫ آزمون­های احیای نیترات
برخی از مایکوباکتریوم­ها می­توانند نیترات را توسط آنزیم نیتروردوکتاز به نیتریت احیاء کنند.
روش کلاسیک با معرف­های مایع
۳-۵-۲-۱٫ معرف­ها و مواد لازم تست نیترات

• محلول نیترات: نیترات سدیم (NaNO3)، مونوپتاسیم فسفات (KH2PO4)، سدیم دی فسفات آبدار (Na2HPO4+12H2O)
• معرف­ها: اسید کلریدریک غلیظ (۱ قطره)، سولفانیل آمید (۲ قطره)، N–نفتیل اتیلن دی آمید (۲ قطره) (در یک ظرف شیشه ­ای تیره در یخچال نگهداری می­­شوند)
• وسایل و مواد مورد نیاز: آب مقطر، پودر روی (Zn)، لوله­های آزمایشگاهی، حمام آب گرم (بن ماری)

۳-۵-۲-۲٫ آماده ­سازی معرف­های تست نیترات

• معرف ۱: ۵۰ میلی­لیتر از HCL غلیظ با دقت به ۵۰ میلی­لیتر آب مقطر افزوده ­گردید.
• معرف ۲: ۲/۰ گرم از سولفانیل آمید در ۱۰۰ میلی­لیتر آب مقطر حل ­شد.
• معرف ۳: ۱/۰ گرم از پودر N-نفتیل اتیلن دی آمین هیدرو کلراید در ۱۰۰ میلی­لیتر آب مقطر حل گردید.

۳-۵-۲-۳٫ مراحل انجام کار تست نیترات

• ۲ میلی­لیتر از سوبسترای نیترات سدیم (NaNO3) به لوله­های آزمایشگاهی افزوده ­شد.
• با یک پارو از ارگانیسم ۴ هفته­ای که بر روی محیط LJ رشد کرده بودند، برداشته و به محلول اضافه ­گردید.
• لوله با دست به آرامی تکان داده ­شد و بصورت عمودی در انکوباتور ۳۷ درجه ۲ ساعت قرار گرفت.
• پس از انکوباسیون یک قطره از شناساگر ۱ به لوله افزوده ­شد.
• از شناساگر دو، ۲ قطره به لوله افزوده شد.
• از شناساگر سه، ۲ قطره به لوله افزوده ­شد.
• به محض افزودن شناساگر سه، تغییر رنگ صورتی باید دیده می­شد.

۳-۵-۲-۴٫ استاندارد­های احیاء نیترات
محلول­های استوک