۳-۳- طرز آلوده کردن کنه ها با سوسپانسیون کنیدیوم قارچ:
کنه ها بلافاصله پس از رسیدن به آزمایشگاه در الکل اتیلیک۷۰% ضد عفونی شدند. سالم بودن کنههای بالغ مهم بود و در اسرع وقت پس از جمع آوری مورد ارزیابی قرار گرفتند. کنه های صدمه دیده و تغییر رنگ داده حذف شدند. کنه های سالم دارای حرکت بودند و برای ارزیابی چنانچه کنه ها در زیر یک منبع نور قرار می گرفتند به سمت نور حرکت میکردند ]۱۷٫[
برای انجام آزمایش، سوسپانسیونی حاوی ۱۰۷×۴/۲، ۱۰۹×۴/۲ و ۱۰۱۱×۴/۲ کنیدیوم در هر میلی لیتر از هر کدام از ۴ جدایه تهیه گردید و در یخچال با دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد.
برای هر جدایه قارچی سه گروه درمان (۳ بارتکرار) از هر کنهی مورد آزمایش، در غالب گروه های ۱۰ تایی کنه در نظر گرفته شد، هم چنین ۳۰ عدد کنه به عنوان گروه کنترل منفی در سه گروه ۱۰ تایی جای گرفتند که در مجموع تعداد ۳۹۰ کنهی هیالوما مارجیناتوم بالغ مورد استفاده قرار گرفت.
در گروه های درمان، کنه ها به صورت انفرادی به وسیلهی پنس استریل ۵-۳ ثانیه در سوسپانسیون قارچی مربوطه و در گروه کنترل منفی نیز کنه ها ۵-۳ ثانیه در آب مقطر استریل همراه با توئین ۸۰ بدون اسپور، غوطه ور شدند. پس از غوطه وری، کنه ها به پتریدیشهایی که حاوی کاغذ صافی (کاغذ واتمن) مرطوب بود منتقل گردیدند. سپس در ژرمیناتور با دمای ۲۵ درجه سانتیگراد و رطوبت ۷۰ درصد قرار گرفتند. لازم به ذکر است کاغذ های واتمن قبل از استفاده اتو کلاو شدند و هر روز پس از مطالعه کنه ها چند قطره آب مقطر استریل به کف ظروف جهت تامین رطوبت اضافه گردید.
تمامی گروه های مورد آزمایش به صورت روزانه، به مدت ۲۰ روز مورد مشاهده و بازبینی قرار گرفتند و تلفات و رشد قارچ روزانهی آنها ثبت شد.
۳-۴- روش آنالیز اطلاعات بدست آمده:
متوسط درصد آلودگی و تلفات کنه هیالوما مارجیناتوم در مطالعه حاضر در یک طرح خرد شده با در نظر گرفتن اثرات اصلی هفته، نوع قارچ، غلظت قارچ و تداخل سه طرفه با کمک رویه GLM (General linear Model) مورد آنالیز واریانس (Analysis at variance) دوطرفه قرار گرفت. تست توکی (Tukey) برای مقایسه میانگین ها مورد استفاده قرار گرفت. نتایج به صورت حداقل مربعات میانگین و خطای معیار میانگین بیان شد. مقادیر۰۵/۰≥p به عنوان معنادار تلقی گردید. نرم افزار آماری SAS (Statistical Analysis system) برای تخمین اطلاعات مورد استفاده قرار گرفت.
فصل چهارم
نتایج حاصل از آزمایش پایلوت بر روی کنه بالغ هیالوما مارجیناتوم:
ازآنجایی که هیچ گونه اطلاعی از اثرقارچ ها بر روی کنه هیالوما مارجیناتوم وجود نداشت تستی مقدماتی و غربالگری انجام گردید تا قارچ های با اثر کشندگی بهتر انتخاب گردند و از کاربرد قارچ ها با اثر ناچیز و حتی بی اثر بر روی کنه جلوگیری گردد. چرا که در غیر اینصورت با در نظر گرفتن ۳ رقت برای هر جدایه و تکرار آن به شکل سه بار تکرار در شرایطی که بنا بود ۱۰ کنه در هر پتری پلیت استفاده گردد برای هر جدایه قارچ حدود ۹۰ کنه نیاز بود بنابراین با در نظر گرفتن گروه های کنترل حدود ۴۵۰ کنه برای مطالعه می بایست مورد استفاده قرار گیرد که مطالعه میزان اثر جدایه ها و تعیین مرگ و میر کنه ها در اثر این قارچ ها به شکل سه بار تکرار و غلظت های گوناگون عملا از لحاظ کشت و جمع آوری کنه و مطالعه غیر ممکن بود بنابراین در این مرحله حد اکثر سوسپانسیون قارچی شامل ۱۰۱۱×۴/۲ اسپور در هر میلی لیتر برای هر جدایه قارچی و ۵ کنه برای مطالعه هر جدایه در نظر گرفته شد تا میزان مرگ و میر کنه ها و به عبارتی بیماریزایی هر کدام از جدایه های قارچی توسط شناور کردن ۵ کنه هیالوما مارجیناتوم بالغ که قبل از آغشته کردن با اسپور قارچی با الکل ۷۰ در صد ضد عفونی و خشک گردیده بودند مشخص گردید. مدت این آغشته کردن ۵-۳ ثانیه بود و پس از این کنه ها در پتری دیش های استریل حاوی کاغذ صافی مرطوب قرار می گرفتند[۲۵].دما و رطوبت حاصله توسط ژرمیناتور تهیه گردید البته جهت اطمینان از رطوبت کامل، پلیت ها در دسیکاتوری قرار گرفتند که در کف آن آب و نمک اشباع قرار داشت و دسیکاتور در ژرمیناتور قرار گرفت. برای تمام جدایه های قارچی یک گروه کنترل شامل ۵ کنه بالغ به همان روش ذکر شده مورد درمان قرار گرفت، به جز این که کنه ها در آب مقطر استریل همراه با توئین آغشته گردیدند. مرگ و میر کنه ها به طور روزانه هر ۲۴ ساعت یک بار مورد مطالعه قرار گرفت و ثبت گردید و کنه های تلف شده در اثر قارچ مشخص و این لاشه ها به ظروف دیگری منتقل گردید تا رشد و نمو قارچ بر روی آنها مورد مطالعه قرار گیرد[۴۶].
طی این مطالعه تاثیر قارچی متاریزیوم آنیزوپلیه DEMI 001 ،M14 ، IRAN 437C، IRAN 715 C بررسی شد و تعداد ۴ گروه پنج تائی از کنه های بالغ هیالوما مارجیناتوم مورد ارزیابی قرار گرفتند که در جدول ۴-۱ نشان داده شده است.
جدول ۴-۱: گروه های تحت درمان در اثر کنیدیوم های مختلف قارچی با غلظت ۱۰۱۱ ×۴ /۲ کنیدیوم در هر میلی لیتر

جهت دانلود متن کامل پایان نامه به سایت azarim.ir مراجعه نمایید.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

گونه	جدایه	درصد مرگ و میر ۱۴روز پس از تلقیح
متاریزیوم آنیزوپلیه	IRAN437C	۵۰
متاریزیوم آنیزوپلیه	IRAN715C	۵۰
متاریزیوم آنیزوپلیه	DEMI001	۱۰۰
متاریزیوم آنیزوپلیه	M14	۱۰۰

نتایج حاصل از مطالعه مقدماتی نشان می دهد که قارچ های آزمایش شده حدتشان در برابر کنه های بالغ هیالوما مارجیناتوم متفاوت است و میزان مرگ و میر کنه های تحت درمان بین ۱۰۰-۰ درصد ۱۴ روز پس از تلقیح کنه ها با غلظت ۱۰۱۱ ×۴/۲ کنیدیوم در هر میلی لیترگردید. ضمن این که مرگ و میر در گروه کنترل صفر درصد گردید. تمام کنه های تحت درمان ۱۴ روز پس از تلقیح کنه ها با کنیدیوم های قارچی در اثر متاریزیوم آنیزوپلیه جدایه M14 و متاریزیوم آنیزوپلیه جدایه DEMI001 تلف گردیدند(جدول ۱-۵).
فصل پنجم
نتایج حاصل از آزمایش نهایی بر روی کنه بالغ هیالوما مارجیناتوم:
جدول۵-۱: گروه های تحت درمان در اثر غلظت های مختلف کنیدیوم های قارچی