است که جزء نشانگرهای بارز میباشد و هتروزیگوتی و هموزیگوتی را نمیتوان با بهره گرفتن از آن تشخیص داد همچنین این نشانگر در مقایسه با نشانگرهایی مثل ریزماهواره که تنها اطلاع از یک مکان ژنی خاص را میدهد، در زمره نشانگرهای چند مکانی ژنی است و اطلاعات روی تعداد زیادی مکان ژنی قرار دارند. اطلاعات ژنوتیپی از هر مکان ژنی نیز به واسطه بارز بودن آن کاهش مییابد. به هر حال به خاطر قابلیت سرعت، آسانی، کیفیت و قابل اطمینان بودن آن، به عنوان یک ابزار مولکولی مناسب برای اکولوژیستها و بیولوژیستهای مولکولی مورد توجه است (مولر و ولفنبرگ، ۱۹۹۹). همین روش ساخت cDNA-AFLP به ما اجازه میدهد تا ژنها و رونوشتهایی که در تحمل به نقش دارند، شناسایی شوند و سپس بیان آنها را در پاسخ به تنش مانند تنش خشکی بررسی شود (گاپتو و همکاران^[۱۰۶]، ۲۰۱۲).

الف - مراحل روش کار با این نشانگر به صورت زیر میباشد (نقوی و همکاران، ۱۳۸۴)

1. برش DNA ژنومی با دو آنزیم برش دهنده و اتصال به سازگارها:

ابتدا DNAی ژنومی باید به کمک آنزیمهای برشدهنده به درستی برش داده شود. یکی از آنزیمهای برشدهنده ۶ بازبر (مثل آنزیم EcoRΙ، PstΙ با HindllΙ که توالی ۶ بازی را برش میدهد) میباشد و دیگری آنزیم ۴ بازبر (مثل آنزیم MseΙ و TaqΙ که توالی چهار بازی را شناسایی و برش میدهد) باشد. استفاده از آنزیم چهار بازبر به این دلیل است که قطعههای حذفشده کوتاه با اندازه مناسب برای تکثیر PCR ایجاد شود و این قطعهها دارای اندازهی بهینه برای تفکیک روی ژل هستند.
آنزیم شش باز نیز برای کاهش دادن قطعههای تکثیر شونده بهکار میرود. اما طراحی شرایط AFLP طوری است که تکثیر غالب مربوط به قطعههای برشی است که یک آنزیم چهار بازبر در انتهای دیگر دارند. پس از برش DNA توسط آنزیمهای برشدهنده سازگار سازهای الیگونوکلئوتید دو رشتهای با دوازده تا بیست جفت باز به هر دو انتهای قطعههای برشی چسپنده اضافه میشوند. این مرحله از کار را چسپاندن مینامند و جایگاه اتصال آغازگر برای تکثیر PCR در این مرحله مهیا میشود.

1. تکثیر پیش از مرحلهی انتخاب (Pre – selective amplification)

ردیفهای سازگارساز و جایگاههای برشی به عنوان جایگاههای اتصال آغازگر برای تکثیر PCR پیش از مرحله انتخاب است. آغازگرهای پیش از مرحلهی انتخاب هر کدام یک نوکلئوتید انتخابی در انتهای ۳΄(برای آغازگرهای EcorΙ و MseΙ) دارند و یا نوکلئوتید انتخابی ندارند (برای آغازگر PstΙ). محصولات اولیهPCR پیش از مرحله انتخاب قطعههایی هستند که در یک انتها با آنزیم چهار باز بر و در انتهای دیگر با آنزیم شش باز بر برش داده شدهاند و همچنین دارای نوکلئوتید داخلی همساز (در حالتی که یک نوکلئوتید داخلی انتخابی در نظر گرفته شده باشد) هستند. استفاده از یک نوکلئوتید انتخابی در انتهای ۳΄ آغازگر تعداد قطعههای برشی را ۱۶ مرتبه کاهش میدهد. در حقیقت در این مرحله الگوهای DNAهای مناسب برای مرحلهی تکثیر انتخابی فراهم میگردد. کاهش در تعداد قطعههای DNA به همراه کاهش بیشتر در مرحله انتخابی برای این است که از تعداد زیادی از قطعههای DNAهای ایجاد شده، فقط قطعههای ویژهای تکثیر شوند. علاوه بر آن تعداد زیاد باند سبب ایجاد لکه بر روی ژل الکتروفورز میشود.

1. تکثیر انتخابی (Selective amplification)

در این مرحله از آغازگرایی که فقط دو نوکلئوتید انتخابی (آغازگر PstΙ ) با سه نوکلئوتید انتخابی (آغازگرهای ECORΙ و MseΙ) در انتهای ۳΄دارند، برای تکثیر قطعهای الگو استفاده میشود. معمولا توصیه میشود در گونههایی که ژنوم کوچک دارند از دو نوکلئوتید انتخابی و در گونههایی که ژنوم بزرگ دارند از سه نوکلئوتید انتخابی استفاده شود.
۱-۲-۹- واکنش زنجیرهای پلیمراز ( ^[۱۰۷] (PCR
این تکنِیک در اواسط دههی ۱۹۸۰ بوسیلهی کری مولیس معرفی شد. به دلیل کاربردها و مزیت های بسیار زیاد آن به سرعت در زیستشناسی مولکولی گسترش پیدا کرد. امروزه این روش تقریبا در تمامی آزمایشگاههای زیست مولکولی جزو کارهای متداول میباشد و به صورت خودکار بوسیله یک کامپیوتر انجام میشود. این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیستمولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را برطرف کرد. برای مثال قبلاً برای بهدستآوردن نسخههایمتعدد از یک ژن خاص میبایست این ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در یک باکتری تکثیرکنند. ولی امروزه اینکار را به سادگی و با بهره گرفتن از PCR انجام میدهند.PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است (یزدی صمدی و همکاران، ۱۳۸۰). سرعت و سادگی روش PCRبه همراه افزایش تنوع محصولات مربوطه باعث علاقهی بسیار جهت استفاده از PCR در آزمایشها شده است.PCR با بهره گرفتن از اجزای همانندسازی طبیعی DNA، در داخل لوله آزمایش DNA را تکثیر مینماید.
PCR طی سه مرحله مجزا که با دما مشخص میشوند، انجام میگیرد (شکل ۱-۱):
- ابتدا DNA الگو تقلیب (denature) میشود تا رشته های مکمل جدا شوند. دمای مورد نیاز برای این مرحله c°۹۴ میباشد.
- در مرحله بعد واکنش، تا رسیدن به یک دمای اتصال (annealing) سرد میشود تا پرایمرهای الیگو نوکلئوتیدی بتوانند به DNA الگو متصل شوند. طی مرحله اتصال، DNA پلیمراز مقاوم به حرارت فعال بوده و به محض اتصال پرایمرها بهDNA الگو، افزایش طول آنها را آغاز خواهد کرد. دمای مورد نیاز جهت اتصال پرایمرها °c72-40 (غالبا شروع با °c55) میباشد.
- نهایتا واکنش تا رسیدن به دمایی نزدیک به دمایی نزدیک به دمای بهینه فعالیت آنزیم پلیمراز حرارت داده میشود، که c°۷۲ دمای بهینه برای بسیاری از DNA پلیمرازهای مقاوم به حرارت میباشد.
- تکرار سه مرحله بالا برای ۴۰-۲۵ بار، که بستگی به کاربردهای خاص دارد.
نهایتا واکنش تا دمای اتاق یا C°۴ سرد میشود که بستگی به کاربرد محصول و نوع ترموسایکلر مورد استفاده دارد (کریمی و همکاران، ۱۳۸۳).
شکل۱-۱- واکنش زنجیرهای پلی مراز(PCR)
۱-۲-۱۰- بیان ژن
بیان ژن فرایندی است که در آن اطلاعات بیولوژی درون ژن استفاده می‌شود تا یک محصول کاربردی از آن بهدست آید. محصول ژنها عمدتا پروتئین‌ها هستند و از محصولات غیر پروتئینی می‌توان به rRNA،tRNA،snRNA اشاره کرد. فرایند بیان ژن بوسیله تمام یوکاریوت‌ها و پروکاریوت‌ها (باکتری‌ها و غیره) انجام میگیرد. مراحل مختلفی را می‌توان برای فرایند بیان ژن در نظر گرفت که عموما شامل رونویسی، اتصال RNA، ترجمه و تغییرات بعد از ترجمه یک پروتئین می‌باشد. تنظیم ژن به سلول این امکان را می‌دهد تا بتواند ساختار و کاربرد خود را کنترل کند و این مسئله پایهای برای تفاوتهای سلولی، دگرگونی (تکامل) و مهارت تطبیق ارگانیسمها با شرایط جدید است. تنظیم ژن همچنان می‌تواند به عنوان یکی از زیر لایه های تکامل در نظر گرفته شود چونکه کنترل زمانبندی، مکان و مقدار ژن می‌تواند تاثیرات مهمی در عملکرد ژنها درون سلول یا کل ارگانیسم پرسلولی داشته باشد. در علم ژنتیک، بیان ژن یکی از مهمترین مسائل بنیادی است که کمک میکند تا ژنوتیپ به صورت فنوتیپ ظاهر شود. درواقع کدهای ژنتیکی که در رشته های DNA ذخیره شدهاند بهوسیله بیان ژن تفسیر میشوند و خصوصیات و نحوه بیان ژن باعث بهوجود آمدن فنوتیپ در ارگانیسم خواهد شد (یزدی صمدی و ولیزاده، ۱۳۸۰).
۱-۲-۱۰-۱- مراحل مختلف بیان ژن
الف- رونویسی
تولید یک کپی RNA از روی DNA را مرحله رونویسی مینامند (یزدی صمدی و همکاران، ۱۳۸۰)، به عبارت دیگر واکنش رونویسی ساختن یک مولکول RNA میباشد. این فرایند بوسیله ی RNA polymerase انجام میشود. نکته کلیدی آغاز رونویسی این است که یک آنزیم RNA پلیمراز باید در جایگاه آغاز رونویسی که به وسیله پروموتر یا راهانداز مشخص میشود، و درست در دست بالای ژنی که باید رونویس شود قرار میگیرد. همانطور که در شکل ۱-۲ مشاهده میشود رونویسی با حضور الگوی ۳ DNA تنظیم میگردد و DNAی الگو ترتیبی که نوکلئوتیدهای منفرد به RNA پلیمریزه میشوند را هدایت میکند. بنابراین رونوشت ۵RNA به شکل گام به گام ساخته میشود تا اینکه در هر لحظه یک نوکلئوتیدRNA را به رشته RNA درحال تولید، اضافه شود. رشته RNA با رشته DNA اصلی (غیرالگو) یکسان است تنها با این تفاوت که در آن به جای تیمین(T) از اوراسیل(U) استفاده شده است. عمل رونویسی پس از رسیدن به یک توالی مشخص خاتمه مییابد (مجد و همکاران، ۱۳۸۰).
شکل۱-۲: رونویسی- تولید یک کپی RNA از روی DNA.</stron g>
در پروکاریوتها مولکولهای mRNA رونوشت مستقیم ژنها هستند (جز درارکیباکترها) و تقریبا بدون تغییر و همزمان با رونویسی عمل ترجمه آنها آغاز میشود. اما در یوکاریوتها مولکولهای mRNA پس از رونویسی عمل پردازش (شکل۱-۳) یا حذف اینترونها و اتصال اگزونها صورت میگیرد.
شکل۱-۳: پردازش- مرحله حذف اینترون و اتصال اگزونها
ب- ترجمه
برای بعضی ژنها رونوشت RNA محصول نهایی بیان ژن است (شکل ۱-۴). در ژنهای دیگر این رونوشت دستخوش مرحله دوم بیان ژن یعنی ترجمه میشود. در حین عمل ترجمه مولکول RNA (که RNAی پیک یا mRNA نامیده میشود)، ساختن یک پلیپپتید را هدایت میکند بهطوری که توالی اسیدهای آمینهی آن به وسیلهی توالی نوکلئوتیدی mRNA تعیین میشود، (که آنهم از توالی نوکلئوتیدی ژن بهدست آمده است). هر سه باز ریبونوکلئوتیدی متصل بههم یا تریپلت محل استقرار یک اسید آمینه خاص را تعیین میکند و تشخیص اسیدآمینه مربوط به هر تریپلت توسط رمز ژنتیک مشخص میگردد. ساخت پروتئین کلید اطلاعات ژنتیکی است، در مورد همه ژنها نقطه پایانی بیان ژن ساختن یک مولکول RNA یا یک پلی پپتید است (یزدی صمدی و ولیزاده، ۱۳۸۰).
شکل۱-۴: ترجمه- ساخته شدن پلیپپتید
۱-۲-۱۱- واکنش نسخهبرداری معکوس^[۱۰۸]
اساس RT-PCR بر آنزیم نسخهبردار معکوس، یک DNA پلیمراز وابسته به RNA، و توانایی آن برای ساخت رشته DNAی مکمل (رشته اول cDNA) از روی mRNA الگو بنا شده است. واکنش نسخهبرداری معکوس را میتوان روی RNA کل سیتوپلاسمی و یا بر روی mRNA خالصشده انجام داد. نکته مهم این است که DNA ژنومیک نیز میتواند به عنوان PCR عمل کند. یک کنترل مناسب جهت بررسی آلودگی واکنش با DNA ژنومی یک واکنش شاهد است که در آن مرحله نسخهبرداری معکوس انجام نشده است. بسیاری از کیتهای تجاری، خالصسازی RNA کل و یا mRNA را با کیفیت بالا و عاری از DNAانجام میدهند، ولی میتوان در مراحل خالصسازی RNA یک مرحله هضم با DNASE I عاری از RNASE (Rnase free dnase I) قرار داد.
مرحله بعدی تبدیل mRNA به رشته اول cDNA میباشد. این کار اغلب با بهره گرفتن از پرایمر Oligo-dt انجام میشود که میتواند به دم پلی mRNA ۳´A یوکاریوتها متصل شود و امکان cDNA را از روی مولکولهای mRNA موجود در واکنش توسط آنزیم نسخهبردار معکوس فراهم سازد. این کار را میتوان بر رویmRNA جدا شده از ستون و یا بر روی mRNA جذب شده بر روی یک بستر جامد انجام داد. در نهایت بررسی محصولات حاصل از تکثیر RT-PCR انجام میشود (کریمی و همکاران، ۱۳۸۳).
۱-۲-۱۱-۱- PCR به همراه نسخهبرداری معکوس (RT-PCR)
بررسی بیان ژن نیاز به تعیین دقیق میزان mRNA دارد، ولی اساس PCR تکثیر DNA است نه RNA اکنون سوال این است که چگونه میتوان از آن برای بررسی RNA استفاده کرد؟ برای اینکار ابتدا RNA را با بهره گرفتن از روش کاملا شناخته شده نسخهبرداری معکوس که در حالت طبیعی توسط ویروسهای RNA دار برای تبدیل RNAی ژنومی آنها به DNAدر داخل سلول میزبان بهکار میرود، تبدیل به DNAمیشود (شکل ۱-۵). سپس تکثیر PCR بر روی cDNA (DNA مکمل Complementry) بهدست آمده میگیرد (کریمی و همکاران، ۱۳۸۳).