۲-۶-۳-بررسی آپوپتوز سلولی
وجود فسفاتیدیل سرین^[۴۹] در سطح سلول از نشانه های وقوع آپوپتوز است. از آنجاییکه Annexin در حضور یون کلسیم تمایل زیادی به اتصال به فسفاتیدیل سرین دارد، بنابراین از آن در تشخیص آپوپتوز سلولی استفاده می شود (۳۳). برای بررسی آپوپتوز سه حجم ۱۰^۵×۵-۱ سلول مورد نیاز است.

دو حجم از این سلولها با بهره گرفتن از بافر کلسیم^[۵۰] ۱x شستشو داده شد و ۱۰۰ میکرولیتر بافر کلسیم ۱xو ۵ میکرولیتر AnnexinV FITC به سلول های هر حجم اضافه گردید و به مدت ۱۵ دقیقه انکوباسیون بر روی یخ و در شرایط تاریکی انجام گرفت.
پس از اتمام زمان انکوباسیون، سوسپانسیون سلولی با اضافه کردن PBS و سانتریفوژ (۱۵ RPM به مدت ۵ دقیقه) شستشو داده شد و در نهایت ۱۰۰ میکرولیتر PBS و ۳ میکرولیتر رنگ PI به رسوب سلولی اضافه شد.
مطابق با ارزیابی بقای سلولی، در این تست نیز ابتدا نمونه ی سلولی بدون رنگ توسط دستگاه شمارش شد و نمودار FSC vs SSC و ^[۵۱] FL₁^[52] vs FL₂ رسم شد تا جمعیت سلولی در محل صحیح قرار گیرد، سپس نمونه ی حاوی AnnexinV FITC برای اصلاح هم پوشانی رنگ های فلورسنت توسط دستگاه شمارش شد و در انتها نمونه ی حاوی هر دو رنگ در دستگاه شمارش شدند. آنچه به دست آمد جمعیت های مختلف سلولی بودند که در موقعیت های خاص خود قرار داشتند.
CA
B
A
D
شکل۲- ارزیابی وقوع آپوپتوز
A: جمعیت سلول های زنده
B: جمعیت سلولی که دچار آپوپتوز اولیه شده اند
C: جمعیت سلولی که دچار نکروز شده اند
D: جمعیت سلولی که دچار آپوپتوز ثانویه هستند
۲-۷-کشت بافت بیضه
قطعات بافت بیضه در گروه های کنترل و انجمادیI و II بر روی آگار به مدت ۲۰ ساعت کشت داده شدند (۴۵).
۲-۷-۱-آماده سازی آگار
آگار مصرفی با غلظت ۱۵% با بهره گرفتن از آب مقطر اتوکلاو شده تهیه و این محلول در پلیت^[۵۳] ۶ سانتی متری ریخته شد و سپس به مدت چند ساعت در یخچال قرار گرفت تا به حالت جامد در آید، قطعات آگار جامد با بهره گرفتن از تیغ بیستوری به قطعات یک در یک سانتی متری بریده شد (۴۵). لازم به ذکر است که آگار جامد به مدت یک ماه در یخچال قابل نگهداری است.
جهت آماده سازی قطعات برش خورده ی آگار برای کشت بافت در ، سه قطعه آگار در هر چاهک پلیت شش چاهکی^[۵۴] قرار گرفتند و سپس محیط کشت به میزانی اضافه شد که به طور کامل سطح آگار را بپوشاند. پلیت ها به مدت یک روز در انکوباتور با دمای ۳۴ درجه سانتیگراد و فشار ۵% CO2 قرار گرفتند تا محیط کشت کاملا جایگزین آب موجود در آگار شود (۴۵).
۲-۷-۲-آماده سازی محیط کشت
جهت کشت قطعات بافتی در گروه های کنترل و هر دو گروه انجمادی، محیط پایه ی RPMI^[55] حاوی ۱۰% سرم KOSR^[56] تهیه شد.
۲-۷-۲-۱-روش تهیه محیط RPMI
برای ساخت ۱۰۰ میلی لیتر محیط کشت RPMI، مواد زیر به ترتیب به آب دیونیزه اضافه شدند.
Deionized water 100 ml
RPMI (Gibco; Paisley; UK) 1/042 gr
Penicillin / Streptomycin (Gibco; Paisley; UK) 1ml
NaHCo3 (Sigma; MO; USA) 0/2 gr
سپس pH محیط فوق توسط دستگاه pH متر، بین ۶/۷-۴/۷ تنظیم شد و توسط فیلتر دارای منافذ با قطر ۲۲/۰ میکرومتر فیلتر و در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد.
۲-۷-۳-کشت بافت بیضه
پس از ۲۴ ساعت، محیط درون چاهک ها به طور کامل خارج شد و حدود ۳ میلی لیتر محیط کشت تازه به هر چاهک اضافه گردید به طوری که محیط کشت تا چهار پنجم ارتفاع آگار رسید (۴۵)، سپس ۲ قطعه بیضه بر روی هر قطعه برش آگار قرار داده شد و به مدت ۲۰ ساعت در دمای ۳۴درجه سانتی گراد و فشار ۵% CO2 انکوبه شد.
قطعات بافتی در گروه های کنترل و انجمادی، پس از ۳ و ۲۰ ساعت برداشته شدند و ارزیابی های هیستولوژیک، آپوپتوز و مولکولی بر روی آنها انجام شد.
۲-۸-ارزیابی ژن های آپوپتوزی
۲-۸-۱-نگهداری بافت در محلولRNA-later
RNA later^[57] محلول آبی و غیر سمی با خاصیت نفوذ سریع در بافت است، که مانع تخریب بافت و آسیب رسانی به RNAسلولی می شود. باید بافت ها پیش از قرارگیری در RNA later به قطعات کوچکتر از ۵ میلی متر بریده شوند و به ازای هر قطعه ی بافتی، ۵ حجم RNA later استفاده می گردد. نمونه ها پس از قرار گرفتن در RNA later برای مدت نامحدود در دمای ۸۰- درجه ی سانتیگراد قابل نگه داری هستند
۲-۸-۲-استخراج RNA با بهره گرفتن از ترایزول
۲-۸-۲-۱-هموژن کردن بافت^[۵۸]
جهت هموژن کردن بافت، به ازای هر ۳۰ میلی گرم بافت، ۵۰۰ میکرولیتر ترایزول اضافه شد و با ایجاد ضربه با تیغ بیستوری، بافت به قطعات کوچکتری تبدیل گردید. سپس ازطریق ورتکس کردن، بافت به طور کامل هموژن شد و در نهایت سوسپانسیون حاصل به مدت ۵ دقیقه بر روی یخ قرار گرفت.
۲-۸-۲-۲-مرحله ی جداسازی^[۵۹]
۱۰۰ میکرولیتر کلروفرم سرد به سوسپانسیون سلولی افزوده شد، سپس ویال به شدت تکان داده شد تا محلولی به رنگ صورتی- شیری حاصل گردد و سوسپانسیون حاصل به مدت ۵ دقیقه بر روی یخ قرار گرفت. در مرحله آخر نمونه ها به مدت ۱۵ دقیقه در دستگاه سانتریفوژ با دمای ۴ درجه ی سانتیگراد و g12000 قرار گرفتند.
۲-۸-۲-۳-رسوب^[۶۰]RNA
پس از اتمام سانتریفوژ، فاز رویی ویال ها که حاویRNA بود به یک ویال دیگر انتقال داده شد و هم حجم آن ایزوپروپانول^[۶۱] به آن اضافه گردید و به آرامی تکان داده شد، سپس نمونه به مدت یک ساعت در فریزر قرار گرفت. پس از خارج نمودن نمونه از فریزر، نمونه به مدت ۱۴ دقیقه و با دور g12000 و با دمای ۴ درجه ی سانتیگراد سانتریفوژ شد. پس از سانتریفوژ کردن رسوب کمرنگ RNA در کف ویال تشکیل گردید