• گلیسرول (Glycerol reagent grade): 12 میلی­لیتر
• تخم مرغ تازه: ۱۰۰۰ میلی­لیتر
• مالاشیت گرین ۲%: ۲۰ میلی­لیتر
• آب مقطر: ۶۰۰ میلی­لیتر

۳-۲-۲٫ طرز تهیه محیط کشت

• • پس از مخلوط کردن مواد فوق، محلول به مدت ۳۰ دقیقه در ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد اتوکلاو ­شد.
  • پس از سرد شدن محصول در دمای اتاق، ۲۰ میلی­­لیتر از مالاشیت گرین اتوکلاو شده و تازه تهیه شده به آن اضافه ­گردید.
  • برای تهیه این محیط از تخم مرغ­های تازه­ای که بیشتر از یک هفته از عمر آن نگذشته بود، استفاده گردید. ابتدا با یک برس و یک محلول صابونی ۵ درصد روی پوسته تخم مرغ ها کاملا” سائیده شد تا تمیز گردند، سپس تخم مرغ­ها در محلول صابونی ۵ درصد به مدت ۳۰ دقیقه غوطه ور گردیدند. بعد از شستشو با آب، از اتانول ۷۰ درصد برروی تخم مرغ­ها اسپری گردید و به مدت ۱۵ دقیقه تخم مرغ­ها در این وضعیت قرار گرفتند. بعد از شستشو و ضد عفونی کردن دستها با الکل ۷۰ درصد محتویات تخم مرغ را یکی یکی داخل فلاسک استریل شکسته و با تکان­های دست یکنواخت و هموژنیزه ­شدند. تخم مرغ­های هموژنیزه را با یک گاز ۴ لایه استریل فیلتر کرده و داخل یک ارلن استریل ریخته ­شد سپس ۱۰۰۰ میلی­لیتر از تخم مرغ به محلول تهیه شده اضافه گردید.

• مخلوط حاصل با دست تکان داده شد و برای اختلاط کامل، از دستگاه همزن استفاده گردید.
• در شرایط استریل مقدار ۶ الی ۸ میلی­لیتر از محیط کشت در لوله­های آزمایش در پیچ­دار ریخته ­شد و محیط­ها در دستگاه پخت محیط یا کواگولاتور بصورت Slant (شیب دار و مایل) قرار گرفتند تا به مدت ۵۰ دقیقه در دمای ۸۵ درجه سانتی ­گراد پخته شوند.
• محیط­های آماده و پخته شده به مدت ۴۸ ساعت با در نیمه باز (شل) جهت کنترل در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی ­گراد قرار ­گرفت، در صورت عدم آلودگی درب لوله­ها محکم ­گردید.

۳-۲-۳٫ آلودگی­زدایی و تغلیظ نمونه­ها
برای آلودگی­زدایی نمونه­ها از روش N – استیل-L – سیستئین – هیدروکسید سدیم (NaOH-NALC) استفاده ­گردید.
اصولا هیدروکسید سدیم، یک ماده آلودگی­زدای شدیدا سمی می­باشد، که بعنوان یک امولسیون کننده هم عمل می­ کند. افزودن ماده موکولیتیک N – استیل-L – سیستئین (NALC) ، غلضت هیدروکسید سدیم را کاهش داده و زمان لازم برای عمل آلودگی­زدایی را کوتاه می­ کند. بنابراین در به دست آوردن اکثر، باسیل مقاوم به اسید کمک می­ کند .(Forbes B.A and Hicks K., 1993)
مواد مورد نیاز

• محلول­های سیترات سدیم (۹/۲ % یا ۱/۰ نرمال)
• سود (۴% یا ۱ نرمال)
• بافر فسفات ۰۶۸/۰ مولار با ۸/۶ pH= : که مخلوطی به میزان مساوی از محلول­های Na2HPO4 و KH2PO4 است.
• محلول NaOH-NALC : که مخلوطی از سیترات سدیم، سود و NALC است که تازه استفاده می­ شود.

۳-۲-۳-۱٫ آماده ­سازی محلول­ها
تهیه سیترات سدیم ۹/۲ درصد (۱/۰ مولار)

• ۴/۲۹ گرم سیترات سدیم بدون آب به یک لیتر آب مقطر استریل اضافه ­شد و ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد اتوکلاو ­گردید.

تهیه سدیم هیدروکسید ۴ درصد (یک نرمال)

• ۴۰ گرم سود در مقدار کمی آب مقطر حل ­شد، حجم نهایی به ۱ لیتر ­رسید.
• در مرحله بعد ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد اتوکلاو ­گردید.
• در صورت مشاهده هر نوع کدورت و اشکال توده­ای، محلول غیر قابل استفاده خواهد بود.

بافر فسفات ۰۶۷/۰ مولار pH=6/8

• استوک قلیایی: برای تهیه دی سدیم فسفات ۱۵ مولار (Na2HPO4) در یک فلاسک مدرج ۴۷/۹ گرم Na2HPO4 بدون آب اضافه ­شد سپس با کمی آب مقطر حل ­گردید و بعد از انحلال کامل، حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر ­رسید.
• استوک اسیدی: برای تهیه مونو پتاسیم فسفات ۱۵ مولار (KH2PO4) در یک فلاسک مدرج ۰۷/۹ گرم KH2PO4 اضافه ­شد سپس با کمی آب مقطر حل گشته و بعد از انحلال کامل، حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر ­رسید.
• به میزان مساوی از هر دو استوک با یکدیگر مخلوط ­شد و در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد بمدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو ­گردید.

۳-۲-۴٫ روش کار کشت

• در یک لوله سانتریفوژ ۵۰ میلی­لیتری یک حجم از محلول NaOH-NALC به حجم مساوی از نمونه اضافه ­گردید.
• در مرحله بعد لوله­ها توسط ورتکس مخلوط ­شد (زمان اختلاط نباید از ۳۰ ثانیه بیشتر می­شد زیرا NALC در حضور اکسیژن ناپایدار بوده و فعالیت خود را از دست می­داد).
• لوله­ها جهت عمل دکانتامیناسیون (۲۰ الی ۲۵ درجه سانتی ­گراد) به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق قرار ­گرفتند.
• پس از سپری شدن زمان مذکور، مخلوط با آب مقطر استریل یا بافر فسفات به حجم نهایی ۵۰ میلی لیتر ­رسید (با این رقیق سازی، عمل NaOH متوقف شده و از چسبندگی و ویسکوزیته مخلوط کاسته می­ شود).
• در لوله­ها محکم بسته ­شد، چند بار وارونه ­گردید تا محتویات داخل لوله­ها کاملا” مخلوط و یکنواخت گردند.
• لوله­ها در rpm 3000 به مدت ۱۵ الی ۲۰ دقیقه سانتریفوژ ­شدند.
• مایع رویی به یک ظرف محتوی محلول آلوده­زدا حاوی یک ماده ضدعفونی کننده نظیر فنل ۵ درصد منتقل ­گردید.
• به رسوب حاصل، بافر فسفات اضافه ­شد و توسط پی­پت پاستور استریل قسمتی از رسوب را برداشته به محیط کشت انتقال داده شد.
• باقیمانده رسوب را روی لام برده، یک گسترش به طول ۱ تا ۲ سانتی­متر ایجاد ­گردید.
• نمونه­­ها در ۴ لوله حاوی محیط لونشتاین جانسن دار
  ای گلیسرول و لونشتاین جانسن بدون گلیسرول دارای پیرووات کشت داده ­شد. (۲ لوله قبل از عمل دکانتامینه و ۲ لوله بعد از عمل دکانتامینه) درب لوله­ها را نیم پیچ باز ­گذاشته سپس لوله­ها را در انکوباتور۳۷ درجه قرار داده بعد از دو هفته درب لوله­ها را سفت کرده و به مدت ۲ ماه در ۳۷ درجه سانتی ­گراد نگهداری کرده و هر هفته لوله­ها بررسی ­شدند.

۳-۲-۴-۱٫ محیط کشت حاوی تیوفن ۲- کربوکسیلیک اسید هیدرازید